MSstats+：峰强度正常，定量就可靠吗？

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做完一批DIA，鉴定数、总信号和强度分布看起来都正常，差异结果就能直接进入生物学解释吗？某条肽段在后半批进样中逐渐变宽、保留时间开始波动，峰面积却没有明显下降，这类变化很容易留在定量表里。

2026年10月17日，Kohler等在Nature Communications上线MSstats+研究。作者提出：把峰质量及其随采集时间的变化纳入蛋白汇总和差异分析，让不同质量的测量承担不同权重。本文依据出版方已接收、待正式排版版本解读。

鉴定通过，不等于每次定量都同样可靠

鉴定q值用于控制错误鉴定风险；峰形、共洗脱和保留时间偏差则帮助判断这一次峰提取是否稳定。两类信息回答的问题不同。一个前体可以持续通过鉴定筛选，同时在部分进样中出现较差的定量质量。

全局归一化主要处理样本间整体尺度差异。如果异常只发生在某些前体、某段采集时间，单看总信号或一张箱线图容易漏掉。直接删掉整次进样，又可能丢失同一样本中其他可靠的测量。MSstats+把处理粒度落在“某个前体的某次测量”。

MSstats+怎样把峰质量带入统计模型

先保留常规筛选。鉴定、缺失及明显低质量信号仍需按流程处理，不能因后面有加权就放宽上游筛选。模型的前提之一，是筛选后的异常测量相对少见。

再看每个前体的连续变化。作者利用MS1/MS2峰形质量、保留时间偏差等指标，并根据真实进样顺序构建累积变化特征。孤立森林将原始指标与时间趋势合成为异常分数；计算这个分数时不使用峰强度，避免把“信号低”直接等同于“质量差”。

最后降低异常观测的影响。异常分数经转换后参与碎片强度到蛋白丰度的加权汇总，同时估计每次蛋白汇总的不确定性，再传递到差异检验。质量异常的观测贡献降低，汇总结果也保留相应的不确定性。

图1｜对照上下两条流程，重点看Step 3–5：前体质量及时间趋势形成异常分数，继而影响蛋白汇总和差异检验。来源：Kohler等，2026，原论文图1，CC BY 4.0；仅提取图形区域，未改数据。

第40次进样，为什么强度没有提示问题

作者在K562和脑脊液基准中设置已知的两倍差异，并通过逐步降低部分进样的上样量模拟质量退化。在原有分组下，蛋白均有预设差异，主要检验检出能力；另用同浓度进样构建无真实差异的分组，评估假阳性控制。不能只看检出的差异蛋白有多少。

图2以K562中的CRPPA蛋白及一个前体为例：第40次进样的强度并不显眼，但峰形质量及其纵向变化提示异常。引入质量权重后，该例的差异估计更接近预设值。这里比较的是同一制备物的技术重复，不能把它写成生物学重复验证，也不能把稀释实验等同于所有实际仪器故障。

图2｜先比较b的碎片强度与c的质量趋势，再看d的异常分数和后续汇总结果。图f误差线表示汇总估计的不确定性；碎片离子数不等于生物学重复数。来源：Kohler等，2026，原论文图2，CC BY 4.0；未改数据。

易算的多物种测试：已知比例，才能检查测得准不准

重复测量的CV很小，说明结果集中；如果比值始终偏离真值，测量仍有系统偏差。易算在《2025年了，蛋白质组定量精度和深度可以既要又要了么？》中，用人、大肠杆菌和酵母混样开展日间定量测试：人源成分保持不变，另两物种按预设比例变化，重复之间照常采集其他项目样品。这样的设计可同时观察比值偏差、分布宽度和日间重复性。

实际阅读图3时，先看各物种的比值分布是否靠近理论虚线，再看低丰度区域是否明显发散。只报告总体相关性或鉴定深度，回答不了这些问题。原测试使用易肽Micro、Aurora色谱柱及当时的Spectronaut 20；它是特定条件下的历史测试，不代表现售产品在所有配置下的表现。

图3｜易算三物种日间定量测试原图，A质谱8分钟条件。横轴为丰度，纵轴为实测log2比值；人源、大肠杆菌与酵母分别用不同颜色标示，虚线为预设比值。右侧为分布密度。来源：本号2025-07-28文章，未改数值或坐标。该测试跨仪器及方法条件不完全一致，不据此判定仪器优劣。

对应的现售产品是易算定量质控标肽OSSTD023，由人源、大肠杆菌和酵母来源的酶切多肽按已知比例混合，可用于定量准确性与重复性评估。具体比例和接受标准以批次文件为准，不照搬历史文章的混样配方。它适合用于比较方法或版本变化前后的表现；用于日常运行时，还需按项目安排QC进样。

LiP-MS基准：还要检查不该变化的信号是否被误报

易算与上海科技大学水雯箐团队合作的Analytical Chemistry研究，构建了组成和比例已知的人源细胞膜—酵母双物种LiP蛋白组基准，评估七种DIA LiP-MS工作流，并提出DIA-LiPQuan。研究同时关注鉴定、定量比值、假阳性及差异检出，为半特异肽段密集的LiP数据提供方法评价参照。

这里与MSstats+相通的思路，是用已知变化和恒定背景检查结果。两者的分析对象仍有区别：LiP-MS需要保留肽段、切割位点及蛋白总量背景信息，不能直接把常规蛋白丰度的加权结论当成构象变化证据。尝试新统计方法时，应先在匹配的LiP基准中验证，不能因为软件能读入表格，就认定适用。

EasyDIA：先看长期状态，再追到异常测量

EasyDIA是易算已有的质谱数据质控及展示平台，支持实验室仪器运行监控、单项目及大队列质控分析、结果展示与分享。本号2022年的长期运行案例已按色谱、质谱、鉴定和定量四个方面观察变化，涵盖峰宽、RT偏移、质量精度、缺失及定量一致性等信息。

图4｜EasyDIA历史案例原图，横轴为2022年采集日期，蓝线与左轴为峰内扫描点数，黑线与右轴为RT半峰宽（秒）。用于说明沿时间查看系统表现的方法，不是当前系统的实时状态，也不是通用合格阈值。来源：本号2022-06-15文章，未改数据。

实际使用时，可先在项目或时间序列质控中定位异常发生的范围，再回查对应前体与原始峰。MSstats+进一步研究这些峰质量信息怎样参与统计汇总。现有质控监测、已知比例基准、新的统计加权可以相互补充；评估是否接入MSstats+时，应单独核验转换器、输入与输出，不能用一份常规QC报告代替方法运行及验证。

把质控落实到制样与采集

易肽Micro覆盖裂解、酶解与除盐；批量处理可结合固定8通道、支持96孔板的AUTO120工作站。固定步骤与运行记录便于追溯，验收仍应检查肽段回收、酶切表现、空白及重复QC，并保留试剂批次、制备批次、上样量和进样记录。

采集端可使用Biognosys iRT的11条非天然合成参考肽进行RT校准和系统质控，本篇MSstats+论文的K562方法也明确使用了iRT。消化、除盐后加标主要反映后续进样与LC-MS状态，不能据此证明此前前处理回收一致。

论文还使用IonOpticks 25 cm × 75 μm、1.7 μm色谱柱，但未注明代际。当前选型可参考AURORA Series 5的CoreJet一体式喷针与改进nanoZero接头；需匹配离子源、流速和梯度，更换后重建方法与QC基线。本研究未提供第五代色谱柱的验证数据。

Spectronaut用户，先把这些信息导出来

易算现有Spectronaut产品与技术支持可衔接DIA分析和自定义报告导出。原厂现行产品为Spectronaut 21；本论文部分基准使用Spectronaut 19，复现时需保留其真实版本。MSstats+属于后续统计方法，不能因报告来自Spectronaut，就认为软件已自动执行这套质量加权。

第一份：定量及质量报告。保留蛋白、修饰肽段、前体电荷、碎片定量和样本标识，以及前体层级的关键质量指标。作者教程举例包括FG.ShapeQualityScore (MS1)、FG.ShapeQualityScore (MS2)、EG.DeltaRT。指标不是越多越好，应按实际含义选择；列名与可用字段要核对所用软件、报告模板和转换器版本。

第二份：实验设计表。准确对应样本、条件、生物学重复、技术重复及配对关系。不要把同一样品的重复进样当作独立生物学重复，也不要因文件名相近就自动合并样本。

第三份：真实采集顺序及QC记录。时间顺序应来自采集时间戳或进样序列，不能按文件名字母排序；重测、清洗、维护与批次切换也要留记录。只有最终蛋白丰度矩阵，通常无法事后补回这些峰层级质量信息。

从一批有完整记录的数据开始

先选一批具有混合QC、完整进样记录和可回查原始峰的数据，核对转换后的样本对应与字段含义，再固定软件版本、过滤、归一化和统计设置，对比常规与质量加权流程。对于变化明显的蛋白，回查具体前体、异常出现的进样位置，以及它是否改变了效应量和不确定性。

验收时同时看效应量、置信区间、假阳性控制及QC表现。质量加权与批次效应处理作用不同；当分组和进样顺序严重混杂、发生大面积故障，或数据高度稀疏时，需要额外评估。作者也指出，单细胞等极高缺失数据的适用性仍需进一步研究。

准备评估定量方法或建立队列质控，可联系易算沟通多物种定量质控材料、LiP-MS方法评估、EasyDIA项目与长期质控，以及Spectronaut报告与配套实验方案。建议带上样品类型、样本数、仪器与离子源、梯度及报告字段，便于围绕真实流程讨论。MSstats+具体部署与统计适用性需另行评估。

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