文章题目：Decrypting the molecular basis of cellular drug phenotypes by dose-resolved expression proteomics. 文章来源：Nat Biotechnol (2024). 文章链接：https://doi.org/10.1038/s41587-024-02218-y 推荐理由：质谱蛋白组药靶新方案；SP3; 剂量-响应曲线
文章背景
个性化治疗时代，人们已经对药物如何在细胞中发挥作用有深入了解。简单来说药物作用主要依赖于以下三种机制：
与靶标结合：药物直接与特定蛋白结合，改变其功能。
参与信号通路：药物通过影响细胞内的信号传导路径，调节细胞的各种功能。
细胞重编程：药物引发一系列反应，使细胞进入新的状态或导致细胞死亡。
这篇文章特别强调了剂量在药物研究中的重要性，而在传统的蛋白组学研究中，往往忽视了剂量这一关键因素。这篇文章的通讯作者是德国慕尼黑工业大学生命科学学院蛋白组学和生物分析系的主任Bernhard Küster教授。
本文作者开发了一种名为DecryptE的方法，测量约8000种蛋白在不同剂量药物作用下的表达变化，以及生成大量的剂量-响应曲线，提供药物作用机制的新发现。
当你看到DecryptE这个名词，你可能会记得去年三月份，还是这位Bernhard Küster教授团队在《Science》杂志上发表了一篇文章，介绍了一项技术DecryptM-揭示了药物作用和蛋白修饰的关联。而今天要讲的这篇文章更专注于药物剂量对蛋白表达的影响。两者都利用了定量蛋白组学的方法，但DecryptE更强调剂量-响应曲线，上一篇它的姐姐DecryptM则结合了时间和剂量两个维度。马上进入正题。
decryptE方法利用Jurkat细胞作为模型系统，对来自16种药物类别中的144个药物和细胞结合然后做了质谱蛋白组实验。
具体流程如下：
细胞培养与处理：将Jurkat细胞接种在48孔板中，每孔添加适量细胞。然后用从1 nM到10000 nM的5个浓度梯度的药物与细胞孵育18小时，DMSO作为对照组。
蛋白提取与消化：裂解液提取蛋白，再采用SP3（Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample
Preparation）方法进一步做上机前处理。
蛋白组实验：采用microflow-LC-FAIMS-MS/MS做蛋白组学分析。使用每分钟50微升的流速和15 cm的C18色谱柱进行分离。
蛋白鉴定与响应曲线：总共识别8892种蛋白，绘制每种蛋白在不同剂量药物处理下的响应曲线，分析药物的效力（EC50）和效应大小（AUC或相对于DMSO的上下调变化）。生成了1133847条剂量-响应曲线，用于进一步分析药物的作用机制。
数据共享：所有数据都被整理并公开在ProteomicsDB平台（https://proteomicsdb.org/decryptE）中，研究人员可以通过该平台进行数据的可视化和比较。
这个项目有哪些重要的发现呢？
结果一：药物诱导的蛋白组表达变化并不总是能用于药物靶标识别
从decryptE的全局数据分析中得到重要启示是，药物诱导的蛋白组表达变化并不总是能用于药物靶标识别，有以下三点主要原因：
靶标覆盖率有限：虽然研究中识别和定量了8892种蛋白占所有药物已知靶标的66%，但这意味着仍有34%的已知靶标未被覆盖。即许多药物的靶标无法通过蛋白表达变化来识别。
靶标表达变化有限：约25%的药物确实改变了其已知靶标的表达水平，但这意味着大多数药物（约75%）并不会引起靶标蛋白表达的显著变化。即使有变化，也不一定能通过这种方法明显区分出来。
效力和效应大小不突出：即使药物改变了已知靶点的表达水平，该靶点在效力（EC50）或效应大小（曲线下面积或倍数变化）方面也不一定会自己跳出来给自己贴上“就是我我最显著”的标签。例如，胸苷酸合成酶（TYMS）不仅受其直接抑制剂甲氨蝶呤（MTX）和培美曲塞调节，还受63种其他化合物调节。同样，HSP90抑制剂Tanespimycin虽然调节了HSP90的水平，但数百种其他蛋白的调节作用更强，效应更明显。
即使某种蛋白不是药物的靶标，它的表达也会出现药物诱导的变化。因此，仅从药物诱导的蛋白表达变化来普遍或明确地划分药物靶点似乎不太可能。这也说明，药物靶标识别需要结合更多的信息和方法，而不能单纯依赖蛋白组表达变化。
结果二：药物诱导细胞重塑的多组学分析体现药物调控的转录组和蛋白变化之间的差异，源于不同机制
文章通过在相同细胞系和药物处理条件下进行剂量依赖的RNA测序（RNA-seq）实验，检测药物诱导的蛋白表达变化。这些变化既受转录调节，也受转录后和翻译后修饰机制的影响，而且药物对蛋白和mRNA水平的影响可能存在一致或不一致的情况。比如，HDAC抑制剂vorinostat：对HDAC1的蛋白和mRNA水平均无显著变化。CDK4/6抑制剂palbociclib：显著下调了细胞周期调控蛋白RRM2的蛋白和mRNA的表达水平。
此外，研究还探讨了其他具体案例比如DNMT1：在decitabine处理后，蛋白水平显著下降，但mRNA水平没有变化。这与文献中报告的decitabine通过结合DNA导致DNMT1降解的机制一致。其他案例不再一一赘述，这些案例体现药物调控的转录组和蛋白变化之间的差异，源于不同机制。
结果三：药物反应表型按功能对药物做分组
尽管个别药物可能具有不同的靶标，但它们可能导致相似的细胞和分子药物表型。为了探索decryptE 方案是否可以以这种方式对药物进行分组，研究人员对144种药物进行了基因本体（GO）富集分析。
不同的药物被分在一起：研究人员发现药物可以根据其诱导的蛋白表达变化进行分组。例如，PI3K/mTOR抑制剂GSK-1059615、DNA交联剂奥沙利铂和p53激活剂serdematan形成了一个紧密的群（C4），表明这些药物共同下调了一些蛋白。
铂类药物的分开：三种含铂药物奥沙利铂、卡铂和顺铂没有聚集在一起。它们的作用模式不同，例如，奥沙利铂会下调核糖体蛋白，而其他药物不会，它们在细胞中的作用机制存在显著差异。
通过这种分析，decryptE能够将功能相似的药物进行分组而分到一起去，即使这些药物的具体的靶标不同。这种分组方法可以帮助研究人员更好地理解药物的作用机制，并为药物的重新定位和组合疗法找到了新模式。
结果四：HDAC抑制剂对TCR转录下调及其对T细胞增殖和活化的影响
HDAC抑制剂通过抑制HDAC活性，导致TCR成分的转录下调，从而显著影响了T细胞的增殖和活化。这一机制解释了HDAC抑制剂在治疗TCR信号驱动的T细胞淋巴瘤中的疗效。
针对伏立诺他（vorinostat）的剂量依赖性RNA-seq分析表明，HDAC抑制剂使得TCR（如CD3D、CD3E和CD247）的基因转录水平显著下降, 而不是蛋白降解。其他HDAC抑制剂（如panobinostat）也显示出类似的效果，进一步证明了TCR减少是由于HDAC活性的抑制。
TCR复合物是T细胞识别抗原并启动免疫反应的关键。HDAC抑制剂处理后，T细胞无法有效识别和响应抗原。实验结果显示，HDAC抑制剂处理的Jurkat细胞和原代T细胞在结合抗CD3/CD28抗体能力显著降低，反映出T细胞活化能力的减弱。
在TCR信号驱动的T细胞淋巴瘤中，TCR信号通路的过度活化是致病的关键因素。HDAC抑制剂有效抑制了TCR信号传导，从而控制了淋巴瘤细胞的增殖和存活（图5c）。这一机制解释了HDAC抑制剂在治疗此类淋巴瘤中的疗效。
文章启发
剂量-效应曲线揭示新药靶机制：通过设置多个药物剂量并绘制剂量-效应曲线，可以系统地评估药物在不同浓度下对蛋白质表达的影响。确定了药物EC50和效应大小，还能识别出对特定剂量敏感的蛋白，从而发现潜在的新药物靶标和作用机制。
多组学分析的结合：同时测量药物在不同剂量下对转录组（mRNA）和蛋白质组的影响，可以解析药物对基因转录和蛋白质表达调控的不同机制。以及本文是做的质谱蛋白组实验，还有其他实验比如研究蛋白质翻译后修饰（PTMs），如乙酰化和甲基化，以揭示药物在长期作用下对蛋白质修饰的影响，尽管这些数据可能更复杂，但它们对理解药物机制也非常重要。
decryptE方法不同之处： 不同于传统方法仅观察细胞活力或形态变化，而是聚焦药物作用后的蛋白质变化。未来可以结合更快速和灵敏的质谱仪以及新的数据采集技术，进一步提高药物筛选的效率。
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