Nat Commun | DIA联合PQ500与Spectronaut助力蛋白组临床大队列研究应用案例
1、项目整体的分组与执行流程图
小编注：DIA+PQ 500™参考肽试剂盒+Spectronaut， 是开展DIA质谱实验的理想组合。
PQ 500™参考肽试剂盒，靶向582个蛋白质，针对血液、尿液做质谱蛋白组学绝对定量；Spectronaut软件是蛋白组DIA分析的定量数据分析金标准软件。这两款精确定量蛋白的组学产品都出自Biognosys公司。
在血清或血浆中，有意义的低丰度蛋白难以检测，因此会丢失比较多且有意义的蛋白质。为了更好的定量低丰度的蛋白，采用PQ500试剂盒以高灵敏度和重复性定量预定义的关键分子蛋白质集，由于标准品掺入量一般都比较高，可以得到高质量的谱图确保解析成功。再加上Spectronaut质谱分析软件，其算法可直接利用DIA 数据构建虚拟谱图库并进行数据库检索。其算法的定性和定量灵敏度接近DDA 分级建库的结果，可以省去耗时的DDA建库过程。
PQ500结合DIA数据采集，可以提高发现阶段轮廓谱鉴定量，尤其是关键分子的定性的比例和数量，以满足质谱技术全景、无偏向的解析蛋白。再加上Spectronaut软件，对低丰度蛋白的发现、确证和谱图解析能够提供全面而有力的参考。
2、实验设计
血浆和血清样本来自英国两家大学医院（GSTT,KCH）的多个患者队列，包括新冠患者与非新冠对照。
123 名 COVID-19 患者（KCH=16; GSTT=62+45）：在 2 周内的多个时间点对 ICU 中的 78 名SARSCoV-2 阳性患者进行了抽血采样（295份血样），以及住院的非-ICU SARS-CoV-2 阳性患者（n = 45）。
ICU78位患者，在入住ICU后24小时内、1周、2周、出院前采样，这两家医院各自采血清或血浆。非ICU的阳性在住院期间获得血浆。
55名非COVID-19 患者(KCH =12，GSTT=30+13)：非COVID-19 ICU 患者 (n = 25) 和接受心脏手术前的患者 (n = 30) 作为对照，均为血浆样本。ICU的非COVID-19患者，与上述ICU的COVID-19患者采样方法相同（均为入院 + 3个时间点）。
其中，对于蛋白组学实验，采用了DIA+PQ500标准品的策略，样本采用了78名ICU的COVID-19患者（样本集1A（血浆）+1B（血清）），以及43名非COVID-19 患者（样本集3（血浆）+4（血浆）），总共118名患者的391份血液样本。而后采用Spectronaut解析质谱数据。
3、DIA+PQ500的蛋白组学实验结果
3.0 DIA数据如何处理？
在 Spectronaut中分析了上述所有血清和血浆样本的PQ500 SIS 加标 DIA 数据 (Biognosys AG， V14(今年12月将发布V17))，且使用提供的 PQ500 分析插件。
前体和蛋白质 Q 值阈值设置为 0.01。使用峰面积在MS2 水平上进行定量，并使用设置为中位数的全局策略对单个run进行标准化。手动检查报告蛋白质的所有肽段，以确保所有样品的峰积分准确。Q 值大于 0.01 或信噪比小于 5 的肽被标记为缺失。
过滤掉所有样本中缺失值超过 30% 的肽，并使用 K 最近邻(KNN) 算法 (K = 5) 估算剩余缺失值.计算了属于同一蛋白质的肽的 Spearman 相关性。假如每个蛋白质检测到两个以上的肽，如果某肽与剩余肽的相关性小于r = 0.4，则过滤该肽。如果每个蛋白质检测到两个肽段，即使相关性小于r = 0.4，也会留最丰富的肽段。通过汇集定量的肽丰度来计算最终的蛋白质丰度。使用轻/重肽丰度比进行最终的定量比较。
3.1 COVID-19 ICU患者的血浆蛋白质组如何改变？
首先，对COVID-19 ICU患者血浆样本与非COVID-19的血浆对照进行比较，揭示了100种显著改变的蛋白质（q<0.05），分层聚类分析突出显示了一组富含COVID-19的47种血浆蛋白的聚类，包括补体级联成员，以及参与血小板脱粒、急性期反应和凝血的蛋白质。
3.2 蛋白组的变化与28天死亡率的关联如何？
对于100种显著改变的蛋白质，有29种与之前识别COVID-19严重性标志物重叠。那么这些蛋白是否预测已经危重的 ICU 患者的预后？下图C告诉了你答案。
通过对从更大的COVID-19 ICU患者队列（GSTT，n=62）获得的基线血清样本进行分析，只有少数与28天死亡率相关（图C）；CFB、CPN1和SERPINA3均与预后负相关，但校正后，这三种关联均不显著，且在其他蛋白检测平台亦不显著。
很遗憾，与之前识别COVID-19严重性标志物重叠这条线索断了。再回头看100种显著改变的蛋白质，有必要从与以往研究中未报道的分子中继续探索。
很幸运，找到了一些有趣的分子--以往并未发现与COVID-19的严重程度有关，然而本次研究发现其变化与ICU患者的死亡率显著相关（图D）。比较有代表性的有MBL2的升高， PROC、PLG的减少、F7和GC的降低。为了验证 DIA-MS 的发现，亦分析了一个公开的基于其他检测平台的蛋白质组学的数据集。PROC和F7在其他蛋白检测平台亦发现，与死亡率呈负相关。
因此，通过对血浆和血清中的验证可确保蛋白变化与样本类型无关，这对于研究结果的临床适用性很重要。而采用了其他蛋白检测平台，同样也获得了 DIA-MS + PQ500方法测量的与 28 天死亡率相关的重要蛋白PROC和F7，突出了这些不同蛋白质组学方法的互补性。
3.3 分子的背景调研
基于DIA+PQ500的蛋白质组学实验数据提示，补体激活是免疫系统面临 COVID-19 威胁的核心事件，MBL2 升高是 28 天 ICU 死亡率的预测指标。全身补体激活与住院 COVID-19 患者的呼吸衰竭有关，而补体缺乏似乎对 COVID-19 相关的发病事件和死亡事件具有保护作用.
根据其他报道，血清转换前补体因子较高，而血清转换后全身补体激活标志物降低，尽管这项特殊研究未包括因危及生命的 COVID-19 入住 ICU 的患者。补体 (SERPING1、C4A 和CFHR1)、凝血 (F5) 和激肽-激肽释放酶系统 (KLKB1)的失调，在RNAemia的患者中存在失调，而这些途径的联合激活，是血栓炎症的标志。
已知病毒包膜糖蛋白是凝血接触途径的重要触发因素和补体系统. MBL2 与病毒表面的糖蛋白结合，是补体激活凝集素途径的关键分子.在本研究中发现，死亡的 COVID-19 ICU 患者的 MBL2 水平显著升高。此外，文章发现与对照组相比，来自 COVID-19 ICU 患者的血浆中 MASP1（MBL2 的下游分子）增加。
此外，PTX3 对激活补体系统很重要，其表达通过一个独立的、公开数据集（MGH 急诊科COVID-19 队列的研究：https://doi.org/10.1101/2020.11.02.365536）找到，又回到了本项目用ELISA证实其差异倍数、P值均很显著（比 PROC 或 F7 更显著），且以往研究发现是与不良结果最密切相关的蛋白质之一。PTX3是一个相当非特异性的分子，表示“病得要进 ICU”。但PTX3并不是通过本文的DIA+PQ500实验（没有显示来自 KCH 和 GSTT 队列的血浆或血清中 PTX3 丰度的数据）。这个问题我们末尾讲。
MBL2/PTX3 复合物可以直接激活补体系统，而且不依赖于抗原抗体复合物。PTX3 也成为 COVID-19 ICU 患者死亡率的强预测因子。这与其他研究一致。虽然在COVID-19 ICU 患者中存活和死亡的抗 SARS-CoV-2 抗体水平相似，但 MBL2 和 PTX3 与不良结果相关，这表明 COVID-19 中补体激活独立机制的重要性。除了补体系统的成员外，文章还证明LGALS3BP 是 SARS-CoV-2 刺突糖蛋白的新型结合伴侣。
4、机器学习识别biomarker- COVID-19 患者 28 天死亡率的预测因子
文章采用基于机器学习的方法来确定最佳预后标志物。
a,第一步，根据P值<0.05的统计学意义选择单分子的特征。因此，RNAemia, Age, PTX3, Urea被选择为单biomarker候选，将会于多分子组合形成的biomarker比较分类性能差异。
b,第二步，使用封装式特征选择（将特征选择和学习分类模型封装在一起，直接利用分类器的性能 作为特征子集的筛选标准，目的是为分类模型找到最能提升其性能的特征子集）执行二元和三元组合特征搜索， 使用径向基函数 (RBF) 核的支持向量机 (SVM) 分类器。
入围的单分子特征的组合被限制在最多三个，以提高临床实施的便利性并避免过拟合的风险，此外，十倍交叉验证和留一法验证用于避免过度拟合和测试模型泛化。
c, 根据分类器的性能、多重共线性验证和临床相关性，从单分子（步骤a）和组合（步骤b）中进行最终的特征选择。为了反应COVID-19 ICU患者的真实人群，对于分类器的性能，采用了敏感性、PPV和ROC的平均值，将PPV和灵敏度与ROC的AUC结合起来使用，以 解决了单独使用F1分数局限性。
发现二元组合时，出现了两个更好的分类性能的特征：“年龄，RNAemia”和“年龄，PTX3”，表明二元组合是可供选择的最佳特征。
5、纵向蛋白质与SARS-CoV-2 RNAemia和临床改善的关联
蛋白的结果 除了找到biomarker, 同样可以用来识别ICU患者蛋白随时间的变化。
在基线和随时间推移过程中，有九种蛋白质在基线时与RNAemia显著相关；而在来自GSTT队列的纵向血清样本中，与RNAemia阴性的ICU患者相比，在RNAemia阳性的患者中观察到PIGR的增加更多，KLKB1水平随时间显著增加，但在RNAemia阴性ICU患者中趋于更高。COVID-19 ICU 患者的RNAemia与较高的死亡风险相关，这些分子可能是疾病特异性富集的信号。
对于PIGR和KLKB1这两个关键分子参与到了哪些过程？
根据ICU两周内(基线，第1周和第2周，n=47)血清蛋白显著变化，找到了四个不同的蛋白质簇。图中显示28天幸存者（灰色）和非幸存者（红色）之间显著变化的蛋白质簇。
这些蛋白簇通过GO富集注释。发现PIGR处于cluster 2，变化与中性粒细胞脱颗粒蛋白比如S100A8和S100A9密切相关，而KLKB1则与凝血系统(cluster 4)比如F11和SERPIND1相关。
构成这些簇的蛋白质与临床变量之间的同样也有着显著的相关性，由COVID-19 ICU患者基线临床变量与血清蛋白的相关性（患者n = 62）计算而获得。
总结
项目优势：
1、基于DIA技术的蛋白质组学研究发现多个潜在的血浆/血清生物标志物；
2、对血浆和血清中的验证可确保蛋白变化与样本类型无关，这对于研究结果的临床适用性很重要；
3、根据其蛋白质组学轨迹特征找到的不同的蛋白质簇反映了临床状态；
4、DIA结合PQ500, 即每个样本添加PQ500标准品(血液蛋白绝对定量panel)，可以提高发现阶段尤其是关键分子的定性的比例和数量，以满足质谱技术全景、无偏向的定量蛋白。
项目不足以及改进方案：
可惜的是，本文发现的关键分子PTX3 通过文章所在实验室的检测血浆血清蛋白的质谱平台没有体现丰度信息，而是做外部验证的时候用其他蛋白检测平台重新捞回的。如何避免让有意义的蛋白丢失？可以采用高丰度蛋白去除和选择性富集策略来提高分析灵敏度。
来自组织分泌的蛋白、各类细胞因子及已知的很多标志物含量都很低，且往往在某种疾病状态的微环境刺激下表达，往往难以同时检测。比如本文的PTX3就属来自组织分泌的蛋白。
（易算DeeP富集下检测到的PTX3蛋白）
易算开发的EasyPept-DeeP低丰度富集前处理试剂盒在单一体系下对磁性材料进行多种官能团的联合修饰，使其能够在一步操作中无偏向性的富集血液中所有类型的中低丰度蛋白质。简单人工3小时处理即可用于质谱检测，而且没有物种选择性，可以有各种应用，包括疾病检测、诊断、预后、预测对干预的反应和疾病监测。亦可以处理任何物种样品，真正解决了血液质谱蛋白质组的大部分痛点。
易算生物是目前国内 PQ500标准品、Spectronaut软件、EasyPept-DeeP低丰度富集前处理试剂盒唯一销售方。如您感兴趣可以直接与我们联系。
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