Nat Commun|【WGCNA组织样本分析思路】关注脑蛋白组学研究：肌动蛋白纤维和损伤应答对阿尔茨海默病的保护作用

文章题目：Brain proteomic analysis implicates actin filament processes and injury response in resilience to Alzheimer's disease

文章链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-38376-x

发表时间：12 May 2023

组学实验：基于DIA的蛋白质组实验

1、实验设计

患者分组：健康对照组（HC，N=11），阿尔茨海默病抗性组（RAD，N=12）以及阿尔茨海默病症状组（ADD，N=20）

样本类型：脑组织（4个区域）

实验样本的比较：12组两两比较（RAD与HC、RAD与ADD、ADD与HC之间T检验；四个区域分别比较）

框架：从43个研究参与者中获得了155个样本，这些样本分别来自脑部的四个区域。分为三组（健康对照组（HC，N=11），阿尔茨海默病抗性组（RAD，N=12）以及阿尔茨海默病症状组（ADD，N=20））。经过DIA质谱蛋白组分析，对蛋白进行鉴定和定量，再通过差异表达和共表达网络WGCNA对数据进行了分析。最后，文章将结果与四个最接近文章研究设计的独立数据集进行了比较。图b展示了差异表达分析的示意图，并总结了与RAD相关的差异表达蛋白质（RAD DEPs）的最终数量（33个）

2、关键分析

差异分析、区域分析、WGCNA、功能富集分析

2.1 差异分析

目的：找到RAD相关的蛋白

差异表达分析的过程如下所示：

差异分组：对RAD与HC、RAD与ADD、ADD与HC之间进行双侧学生t检验，针对不同脑区比较

差异统计：发现7723个 蛋白质 P值小于0.05（其中RAD vs. HC为1767个，RAD vs. ADD为2658个，ADD vs. HC为3298个）。使用Benjamin-Hochberg（FDR=0.05）控制多重假设检验，确定了85个显著的蛋白质。

韦恩分析：这些显著的蛋白质差异表达（DEPs）中，76%（N=65）是独有，表明大部分组间蛋白质表达差异特定于脑区。

在这85个差异表达的蛋白中，有43个表达在ADD和HC之间存在显著差异，其中只有3个在CAUD脑区（Aβ、MT3、PA1B3）。这一结果证实了文章的组别划分。虑到部分RAD vs. HC和RAD vs. ADD之间的重叠（如SMTG中的Aβ和HIPP中的IF5），最终得到了38个特有的RAD DEPs。其中有5个RAD DEPs在四个脑区中没有检测到，因此被排除在进一步的分析之外，留下了33个用于详细分析的RAD DEPs。

因此，分析过程是通过统计方法对不同组别（RAD、HC和ADD）之间的蛋白质表达进行比较，找出了在RAD组别中与其他组别存在显著差异的蛋白质。最终确定了33个RAD DEPs

2.2 区域分析和RAD DEPs的验证

目的：了解RAD的分子特征

区域分布分析：评估RADDEPs在大脑各个区域的分布情况，并发现IPL中RAD DEPs最多，其次是HIPP，然后是SMTG。

外部数据集验证：将所有的RAD DEPs与四个独立的外部数据集进行比较验证。这些数据集包括Banner Sun Health Research Institute（Banner）、Religious Orders Study and Rush Memory and Aging Project（ROS/MAP）、UPenn Proteomics study（UPP）和Baltimore Longitudinal Study of Aging（BLSA）。通过比较不同数据集之间的一致性来验证RAD DEPs的存在。

相关性分析：对每个RAD DEP与与AD的发病机制或病理发展相关的四种蛋白质（Aβ、APOE、TAU以及TAU-195肽）进行相关性分析。检查RAD DEPs与这些蛋白质的表达水平之间的关系，包括Aβ浓度和TAU磷酸化水平。

个体级别的相关性分析：将RAD DEPs的组织水平表达与43个供体的个体级数据进行相关性分析，评估它们是否与年龄、性别和APOE ε4等因素相关。

组织病理特征的相关性分析：将RAD DEPs的表达水平与组织病理评分（如神经纤维退行和神经树突状斑密度）进行相关性分析，评估它们是否与这些病理特征相关。

主成分分析（PCA）：对RAD DEPs在所有4个脑区的表达水平进行主成分分析，将其转化为每个个体大脑的单一值，以检查更高层次的蛋白质组学特征。通过PCA来观察RAD和ADD群体之间的差异和重叠情况，评估是否能够将它们有效地区分开来。

对于研究集中的四个大脑区域，进行了RADDEPs的多重比较，校正了P值。结果显示，在IPL、HIPP和SMTG这些区域中，RAD DEPs的分布不均匀，并且在不同区域之间存在较少的重叠。
对于四个外部验证数据集，进行了RAD DEPs与AD相关因素（如Aβ、APOE、TAU等）之间的相关性分析。结果显示，RAD DEPs与溶解态Aβ浓度之间存在显著相关性，并且还与其他一些AD相关蛋白质和组织病理特征存在相关性。
绘制了选定RAD DEPs的箱线图，展示了它们在不同区域和组别的表达水平差异。
进行主成分分析（PCA），将所有4个脑区的33个RAD DEPs的表达水平转化为两个主要维度，并根据临床病理组别进行着色。结果显示，尽管HC和RAD组之间存在广泛重叠，但RAD和ADD组之间几乎完全分离，尽管两者都具有AD神经病理变化，但只有ADD组发展为痴呆。

综合上述结果，研究对四个大脑区域和四个外部验证数据集中的RAD DEPs进行了区域分析和验证，并评估了它们与其他AD相关因素和组织病理特征之间的关系。这些分析有助于深入理解RAD的分子特征

2.3 WGCNA分析 

目的：使用WGCNA算法，将分析从单个蛋白质扩展到蛋白质模块，对所有四个脑区检测到的蛋白质进行共识加权蛋白质共表达网络分析。

本文使用共表达网络分析了RAD（退行性脑疾病）的特征蛋白质表达情况。研究发现M5与RAD呈显著正相关，而M1与之呈负相关。这一结果通过外部验证得到了确认，并显示出一致的模式，强调了M5能够区分ADD和RAD，并为AD治疗提供了重要见解。有趣的是，Aβ并不是M5或M1的组成部分，而是属于M0，这意味着它并没有包含在共表达网络中，尽管其在组织浓度方面对RAD和ADD之间的差异具有区分特征。

a)通过蛋白质WGCNA共表达分析，在四个脑区确定了9个模块。使用Pearson相关性和双侧P值评估临床病理组别与特征蛋白质的关系。b) 有三个共表达模块包含了33个RAD差异表达蛋白质（RAD DEPs）。c) 统计了每个模块中预期和观察到的RAD DEPs数量，并进行了富集分析。d) 展示了研究组和外部验证组中，HC、RAD和ADD在模块1和5中特征蛋白质的表达情况。e) 展示了M5中前3个富集的GO生物过程分类及其富集分析结果。f) 显示了M5 z-score的变化模式，临床病理组别的字体大小反映了GO分类内平均z-score的变化。

2.4 功能富集分析 

目的：对WGCNA识别到的M5和M1模块进行了富集分析，以找到与RAD和AD相关的过程。

通过对M5模块的富集分析，发现了与RAD相关的过程。进行了基因本体（GO）分析，确定了三个顶级GO类别：（i）创伤相关、（ii）细胞过程和（iii）解毒。

这些top GO类别包含了八个富集P值排名显著的GO术语，并且与M5蛋白质的特征基因有重叠。

其中，与肌动蛋白纤维过程相关的GO术语排名最高，并且与细胞骨架组装等GO术语共享两个RAD DEPs：ICAM1和CAPG。创伤相关的GO类别包括对创伤的应答和伤口愈合，并且与RAD DEP HSPB1有重叠。解毒的GO类别包括针对有毒物质的细胞反应和解毒，以及其后代细胞解毒，其中包含RAD DEP PRDX1。在M5中检测到的14个RAD DEPs中，有13个在AD中的表达较RAD更高。其中，有5个包含在M5中富集的GO术语中，并且与M5特征蛋白呈明显正相关。这些5个RAD DEPs（CAPG、HSPB1、GFAP、PRDX1、ICAM1）的Spearman相关性与同时存在于GO术语和M5中的蛋白质主要呈正相关。最后，计算了z-score以评估不同GO术语中的项目是上调还是下调时，发现了一些区域和组别模式。创伤相关和细胞过程总是同时变化，RAD在HIPP和异皮质区域的变化比AD少几倍，在CAUD区域的组别差异较小。解毒也展现了类似的表达模式，在HIPP和异皮质区域中，AD相比RAD有显著增加，在CAUD区域组别之间的差异较小。在所有脑区的所有GO类别中，RAD更接近健康对照组而不是AD组。

对于M1模块的富集分析揭示了与AD相关的过程。尽管RAD DEPs在M1中没有显著富集，但还是对M1蛋白质的主要基因进行了GO分析，并确定了四个组别。在前10个GO术语中，有两个包含了M1中的8个RAD DEPs，其中AL1A1包含在代谢物和能量生成的过程中，FRIL包含在阳离子转运中。

最后总结

1. 全面评估大脑：研究团队采用全面评估大脑的方法，以最大限度减少健康对照组（HC）和其他并发症的干扰。这导致了符合研究条件的病例数量的减少，仅有43例符合严格标准。这一意外发现反映了其与之前AD蛋白质组学研究的重要设计上的区别。

   
   

2. 可溶性Aβ浓度的降低：通过双侧学生t检验的分析发现，在所有区域中，RAD组的可溶性Aβ表达呈介于HC组和AD患者组（ADD）之间的趋势。特别是在SMTG区域，RAD组的可溶性Aβ表达显著低于HC组，并且高于ADD组。这一意外发现揭示了RAD具有较低的可溶性Aβ组织浓度，与比AD患者更小的神经元损伤相关。

   
   

   
   

3. 共表达网络分析的模块发现：通过共表达网络分析，确定了M5模块。该模块在RAD组中具有HC ≈ RAD < ADD的模式，这表明M5蛋白的增加可能是皮质和HIPP区域在痴呆进程中的分子特征。这一意外发现暗示了不同脑区的RAD分子机制存在区域差异。

4. 功能富集分析的结果：通过GO分析，发现M5模块的组分蛋白涉及肌动蛋白细胞骨架组织、伤口愈合和细胞解毒等功能。这些发现表明，RAD状态与肌动蛋白丝基过程、伤口愈合和细胞解毒等生物过程的调节相关。

这些意外发现和洞察为我们对RAD的理解提供了新的视角，并为未来研究和治疗AD提供了重要线索。