文章通过应用激光捕获显微切割（LCM）和质谱技术，展示了如何在不同的空间分辨率下，从整个肿瘤组织切片到40微米的精细级别，揭示肿瘤微环境中的蛋白质异质性。研究突出了肿瘤组织中不同区域（如肿瘤实体、肿瘤/非肿瘤边界、免疫细胞浸润区和血管周围）的蛋白质表达模式差异。
文章题目：Deep topographic proteomics of a human brain tumour （人脑肿瘤的深层组织结构研究）
文章来源：Nat
Commun 14, 7710 (2023)
研究创新点：能够在不同的空间分辨率下，从整个肿瘤组织切片到40微米的分辨率，详细映射肿瘤微环境中的蛋白质分布。研究揭示了肿瘤组织中的蛋白质异质性，比如肿瘤实体部分，肿瘤/非肿瘤边界、免疫细胞浸润区域，以及血管周围的蛋白质表达模式。
与别的文章的区别：捞回了【蛋白质表达区域之间的空间关系】的特征。在本研究中，作者使用激光捕获显微切割在三个不同的空间分辨率上进行采样：识别特定区域的特征，比如哪些区域有免疫细胞浸润，哪些区域蛋白质与血管结构有关
技术流程
本文利用蛋白质表达区域之间的空间关系。本文采用激光捕获显微切割（LCM）、样本制备、液相色谱-质谱分析和空间数据统计分析。首先，组织被放置在与激光捕获显微切割（LCM）兼容的载玻片上。
注意：该组织样本的特点，包括其来源、大小、处理方式以及其内在的异质性情况如下：研究的组织样本是一种典型的异形畸胎瘤/横纹肌肉瘤（AT/RT），这是一种特殊的人脑肿瘤，从死后的患者那里获得并经授权使用。该组织样本的尺寸约为20×15毫米。在LCM分析阶段，这一组织被进一步细分为384个方形“体素”，每个体素的面积大约为694,000微米²。切片的厚度为10微米，这种厚度特别适合进行LCM操作和后续的蛋白质组分析。此外，该组织样本自身具有血管和肿瘤组织等异质性特征。
Annotate: 组织划分-组织被划分为规则的网格形状
Cut: LCM分离-网格中的每个元素通过LCM隔离到96孔板的一个孔中
Lyse: 蛋白质裂解-每个样品中的蛋白质在RIPA缓冲液中被裂解
Digest: 肽段消化-裂解的蛋白质被消化成肽段
LC-MS/MS -消化的肽段通过质谱检测
Proteomic Maps: 蛋白质地图-每种蛋白质的定量信息被映射回其在网格化组织中的位置，并在拓扑蛋白质地图中可视化，每种定量的蛋白质有一个地图
切片特点
工作流程被应用于三个不同的长度尺度：
833微米分辨率，覆盖整个肿瘤切片；
350微米分辨率，覆盖两个明显不同区域之间的部分边界；
40微米分辨率，覆盖几个血管及其周围的细胞。
这种方法的目的是建立所需组织面积大小，以在低通量（Orbitrap Fusion Lumos，60分钟梯度）和中通量蛋白质组学平台（TimsTOF Pro，17分钟梯度）中达到4000种定量蛋白质的目标蛋白质组深度。
质谱实验
833微米分辨率:
使用Dionex Ultimate 3000和timsTOF Pro进行LC-MS/MS；使用75μm x 150mm的C18柱，流速为400 nL/min；17分钟的梯度分离，从2%缓冲液B逐渐增加至30%；timsTOF Pro以PASEF模式运行，进行3次PASEF MS/MS扫描。
350微米分辨率:
使用Dionex Ultimate 3000和Orbitrap Fusion Lumos进行nano-UPLC-MS/MS；使用75μm x 500mm的C18 EASY-Spray柱，流速为250 nL/min；60分钟的梯度分离，从2%缓冲液B逐渐增加至35%；MS1扫描范围为400至1500 m/z。
40微米分辨率:
使用Evosep One LC系统和timsTOF SCP质谱仪；使用75μm x 150mm的C18柱，含1.7 µm粒子和集成的Captive Spray Emitter (IonOpticks)；数据通过diaPASEF收集，包括1个MS帧和9个diaPASEF帧。
从人脑的10微米厚切片中收集了面积从316微米²到100万微米²的组织区域。观察到，面积超过316,000微米²的区域在蛋白质鉴定数量不会又显著增加，分别在Orbitrap和timsTOF
Pro平台上的蛋白质鉴定数量介于282至3480和127至3318之间。
关键分析步骤
关键结果
使用833微米和350微米的分辨率进行空间蛋白质组学分析。应用莫兰指数（Moran's I）这一统计方法来检测空间自相关性。结果表明，如PYGL和PRPH这类蛋白质在肿瘤与正常脑组织的交界处表现出显著的空间变化。PYGL在肿瘤组织中高表达，而PRPH在肿瘤周边高表达，揭示了肿瘤微环境中蛋白质表达的空间异质性。
通过833微米的空间分辨率，应用层次聚类和动态树切割算法对样本数据进行聚类分析，将聚类结果映射回其空间位置。使用UMAP可视化这些聚类结果。分析发现，聚类结果形成了空间上连续的区域，如肿瘤实体和脑/肿瘤交界处。接着，通过Wilcoxon Rank Sum测试和MSigDB Hallmark基因集分析每个聚类的标记蛋白。例如，某些聚类显示出与细胞增殖、免疫相关过程或血管生成有关的特征。此外，应用亲和网络融合（ANF）技术进行无偏空间聚类，识别了肿瘤、脑/肿瘤交界、免疫浸润和出血区域等不同表型特征区域。再次用UMAP显示这些聚类结果，发现它们在UMAP图中的位置相近。这些分析揭示了肿瘤微环境中蛋白质表达的空间异质性和功能区域。
通过350微米的空间分辨率，使用层次聚类和动态树切割算法进行聚类分析，并将聚类结果映射回组织样本。聚类结果显示出连续的区域，代表了肿瘤实体（聚类1）、脑/肿瘤交界面（聚类3）以及这两者之间的过渡区域（聚类2、4、5和7）。UMAP降维后，这些聚类在UMAP图中相互靠近。利用火山图（volcano plot）对比聚类3和聚类1，反映出PYGL、ASPH和PRPH等标记候选蛋白的差异丰度。聚类1和3的功能分析表明，参与细胞外基质、细胞黏附与运动、血管生成、免疫过程、表皮功能和神经发育的蛋白质在肿瘤实体和脑/肿瘤交界面之间有差异表达。
40微米的空间分辨率被用于研究血管周围的蛋白质表达模式。DIA-PASEF定量蛋白质。在这个实验中，研究重点是一个包含四个血管的区域，该区域在之前350微米分辨率的分析中表示为一个体素。通过测量细胞到血管的距离，映射了蛋白质丰度与潜在的营养/氧气梯度的关系。观察到血液蛋白与靠近血管的距离呈正相关。空间聚类将组织分为四个主要聚类，代表了不同于血管距离的区域。UMAP降维显示了聚类间的一般分离。此外，对聚类进行MSigDB基因集的富集分析，发现不同聚类表现出与血液相关的功能特征。
使用了833微米的空间分辨率来研究肿瘤组织中细胞外基质（ECM）蛋白质的空间异质性。主要的统计方法包括使用亲和网络融合（ANF）技术进行空间聚类，在通路分析中，使用了Wilcoxon Rank Sum检验来确定每个聚类的标记蛋白用作通路分析的输入。
关键发现包括：不同的胶原蛋白亚家族在肿瘤不同区域的表达差异，以及整合素蛋白在组织中的空间异质性。例如，某些胶原蛋白在肿瘤实体区域表达更高，而其他胶原蛋白在脑/肿瘤界面区域表达更高。此外，一些与ECM相关的其他蛋白质，如CD44、赖氨酸氧化酶（LOX）、透明质酸蛋白（LUM）在肿瘤实体区域表达较低，而在免疫细胞富集区域表达较高。这些结果揭示了肿瘤微环境中ECM组成和功能的复杂性。
总结归纳
作者突出了空间蛋白质组学在揭示生物宏观结构内部的健康和疾病过程中的重要性。他们的方法避免了传统研究中可能出现的确认偏见，能够在没有预先知识的情况下，客观无偏地分析病理组织。通过超过5000个蛋白质组图谱的生成，研究展示了AT/RT肿瘤组织内分子异质性的存在，这有助于未来空间解析转录组学和蛋白质组学研究的整合。作者强调，这一方法提供了关于免疫细胞浸润和状态的发现，为肿瘤微环境提供了全新的认识。他们还指出，未来的研究可能将包括使用机器学习等高级生物信息学工具来解析这些数据。
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