Nature Biotechnology精选：蛋白质组图谱如何助力药物机制探索
背景
本文强调，对有希望的筛选结果和临床前候选药物引起的蛋白质组水平的变化进行检测，可以在开发的早期阶段揭示化合物作用机制 ，从而提高药物发现的效率。这种效率的提高，再加上有可能重新利用具有已知安全性的药物，将对药物上市的成本增长产生积极的影响。
如何更有效地揭示小分子调节剂的作用机制以改进现有疗法和开发新药？
传统的RNA定量技术在研究药物作用机制时存在局限性。高通量质谱（MS）方法已经在分析化学干扰剂诱导的蛋白质表达变化中发挥了关键作用。2023年1月，哈佛大学医学院Steven P. Gygi团队在Nature Biotechnology（影响因子68.1+）上发表了文章“A proteome-wide atlas of drug mechanism of action”。
研究人员开发了一种基于96孔板的高通量筛选技术用于定量蛋白质组学。他们使用这项技术研究了875种药物在人类癌细胞系中的作用，通过检测24小时内的蛋白质组变化，研究人员发现药物诱导的蛋白质表达变化，并揭示了药物如何调控其蛋白质靶点的规律。一些药物，如PARP抑制剂talazoparib、铁螯合剂PAC-1和肾上腺素受体拮抗剂JP1302有潜在的治疗价值。这一资源将为药物发现提供宝贵信息，并揭示药物干扰后蛋白质共表达的基本规律。
假如你做过药物研究，正要做或者已经做过了蛋白质谱实验，那么一定不要错过这篇文章。
药物作用的蛋白质组平台的构建
文章的核心目标是研究不同类型的蛋白质调节剂如何影响细胞蛋白质组的变化，了解不同化学结构的活性，并研究那些尚未充分研究的化合物的影响。
步骤一：作者将875种化合物以三重生物学重复的方式转移至96孔板中生长不足50%密度的HCT116细胞中，每种化合物的浓度为10微摩尔，同时设置DMSO和正对照化合物作为对照组。
步骤二：作者将细胞与化合物孵育24小时后，进行裂解、胰蛋白酶消化和TMT标记。这里有一个特殊处理： 使用一个重复板来筛选有毒化合物，将其移除并用更多的正对照化合物替代。有毒化合物在较低浓度下重新筛选并在单独的11-plex实验中包含。这样的目的是对有毒化合物进行了筛选和重新分析，避免了因为细胞毒性而导致的蛋白质变化的干扰。
步骤三：作者对875种化合物进行了两重生物学重复的分析，使用SPS-MS3定量方法。
实验共进行了172个单独的11-plex实验，总共进行了2176次液相色谱-质谱分析，耗时约4400小时。作者获得了大量的高质量的肽段定量数据（超过1100万个肽段定量）。
通过对96孔板中的细胞进行蛋白质组分析，筛选出的875种小分子药物药物共能够作用于914种蛋白质，占可靶向蛋白质组的一半左右。筛选库中的药物涵盖了不同的临床开发阶段，从经过大量引用的FDA批准的药物到还未大量研究的药。其中近700种药物与库中其他成员共享主要或次要靶点，通过比较这些靶点，可以揭示药物诱导的蛋白质组指纹和药物的脱靶效应。
而且，实验获得了高深度的蛋白质组覆盖率，每种药物平均能够定量8,863种蛋白质，占观察到的9,960种蛋白质的89%。数据完整性很好，有约8,900种蛋白质在至少一半的药物（438种）中被定量。
我们要提这个对照化合物。使用对照是为了检验实验的可靠性和敏感性。如果实验方法和数据分析都是有效的，那么对照应该在每次重复实验中都能够产生一致的结果，而其他药物则应该根据它们的靶点和作用机制产生不同程度的结果。
它能够显著地改变细胞的蛋白质组，也就是细胞内所有蛋白质的种类和数量。对照化合物被用作参照，用来比较其他药物对蛋白质组的影响。对照在整个数据集中被包含了55次，也就是说，在每三组TMT标记的样本中，就有一组是用对照处理的。
蛋白质测量的中位数变异系数（%CV）在控制药物的55次重复实验中为8.8%，在合并两次生物学重复后为6.8%。生物学重复的中位数皮尔逊相关系数（r）为0.87，没有明显的异常值。这些结果显示了测量的重现性和包含及平均生物学重复的优势。
利用该大规模的定量蛋白质组学方法，可以来探索不同化合物对细胞蛋白质表达和相互作用的影响，从而发现了一些新的药物作用机制和潜在的药物靶点。文章发现，每种化合物与一个或多个蛋白靶点相互作用，并通过反映其作用机理的共同和特定的细胞过程的扰动诱导蛋白组水平的变化，对于化合物除了它们的靶标外，还调节许多其他蛋白质。这表明许多调节事件是扰乱重要细胞过程的间接结果，不一定直接由配体-靶点参与引起，因此强调采用共调控网络发现药物作用机制。
靶蛋白的调节为化合物的作用提供依据
如何发现新的药物作用机制
根据此前的这个高通量定量蛋白质组学筛选平台，对人类癌细胞系HCT116进行了875种化合物的处理，并测定了24小时后的蛋白质表达变化以后，将每种化合物处理后的蛋白质表达数据转换为一个蛋白质指纹，即一个包含所有蛋白质的向量，接着他们使用了皮尔逊相关系数（r）来计算每对化合物之间的蛋白质指纹的相似度，并构建了一个化合物-化合物相关矩阵。将化合物-化合物相关矩阵转换为一个网络图，其中每个节点代表一个化合物，每条边代表两个化合物之间的相关性，每个网络簇，代表一组具有相似作用机制的化合物。接下来评估每个网络中化合物之间的作用机制相似度，并将其与已知的靶标和途径信息进行比较，以验证结果的准确性和可解释性。
例如，一个化合物网络将MDM2和CDK4/6抑制剂归为一簇，可能是因为这两类都会诱导G1停滞。你看，这种相互关联的化合物簇，其关联反映了共享生物学特征。
蛋白质-蛋白质和化合物-化合物相关网络来揭示一些化合物的作用机制和靶标，以及化合物之间的多靶点作用和结构-活性关系。
文章还举了一个有趣的例子。PLK1抑制剂volasertib和BI-2536能够诱导相似的蛋白质表达变化，从而形成一个簇。BRD4抑制剂birabresib、CPI-203和JQ-1也能够诱导相似的蛋白质表达变化，从而与PLK1抑制剂簇相关。RVX-208是一种选择性抑制BRD4的BD2结构域的化合物，它与BRD4抑制剂簇有较强的相关性，表明它可能也有抑制PLK1的作用。这些化合物之间的相关性可能反映了它们对细胞周期和染色质重塑等共同途径的影响，也可能反映了它们在结构上的相似性或差异性，从而揭示了它们对靶标蛋白质的结合模式和亲和力。
他们根据靶标蛋白质在HCT116细胞中的表达水平，将化合物分为不同的类别，并发现一些活性化合物的靶标蛋白质在HCT116细胞中不存在。其中之一就是JP1302，它被认为是一个α-肾上腺素受体拮抗剂。
他们发现JP1302处理后的HCT116细胞的蛋白质指纹与一些RNA转录抑制剂，如CBL0137（一种FACT复合物抑制剂）相相关。进一步实验证实了JP1302能够破坏FACT复合物并降解组蛋白H1，从而揭示了这种化合物的两个新靶标。
总结
这篇文章展示了一些利用蛋白质共调控网络发现药物作用机制的例子。这些分析，可以找到比较意外的小分子簇，帮助我们理解化合物之间的相似性和差异性，以及化合物对细胞网络和系统层面的影响。
最后，尽管已经有许多通过基于质谱的蛋白质组学筛查生物标志物、药物的研发, 但却几乎均未能实现转化，这主要是受限于过去技术在检测深度、通量上的缺陷。过去一年来, 随着易算生物技术在实验、分析工具的不断突破, 我们有理由相信为转化落地拓展出一片新的天地。好了，以上就是今天的内容。假如你正在或者将要开展蛋白质组学方面的课题，想找到更多更有价值的信息，请你和我们联系。假如您的朋友目前有开展蛋白组课题的想法，也请你帮我们把这篇文章转发给他。
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