2020年9月，Biognosys携手苏黎世联邦理工在Nature Comm发表利用DIA技术和机器学习研究小分子-蛋白互作研究的最新进展。

化学蛋白质组学技术是研究药物作用机制的利器，它能够确定具有生物活性的化合物的蛋白靶标，但是其缺陷是如果需要确定结合位点的话，必须借助同位素标记或者人工修饰（例如SILAC、Biotin标记等方法）才行。而Biognosys的LiP-Quant方法，结合限制性酶切、DIA定量和机器学习技术，能够精确鉴定和定量药物-蛋白结合靶点，而且其适用范围囊括药物分子所可能结合的激酶、磷酸酶和膜蛋白，并能够估算化合物结合位点的半最大有效浓度（EC50），正确区分同源蛋白以及鉴定诸如灭菌活性化合物的靶标蛋白。

在Biognosys之前的研究中（Cell, Volume 172, Issues 1–2, 11 January 2018, Pages 358-372.e23），LiP技术已经在细菌体系中证明可以在组学水平检测代谢物-蛋白质结合位点。在本文中，Biognosys进一步在人细胞体系中系统性的研究了组学水平的药物-蛋白结合位点。通过LiP-DIA方法分析已知蛋白结合位点的雷帕霉素加入Hela细胞裂解液或Hela活细胞与空载体对比定量，共定量到了5265个（Hela裂解液）和6068个（Hela活细胞）蛋白质。共差异定量到了52个（Hela裂解液）和37个（Hela活细胞）潜在的药物靶标蛋白，其中包括了雷帕霉素已知的靶标蛋白FKBP1A。由于雷帕霉素已知只可能结合FKBP1A，而从该结果来看，非标记DIA差异定量蛋白质组学还无法在复杂细胞全蛋白质组定量中非常精确的将真正的靶标蛋白和其他假阳性结果区分开。这也是蛋白质组学目前还无法完全解决的定量精确性问题。

为了解决这个问题，Biognosys设计了LiP-Quant分析流程。该流程采用Proteinase K进行限制性酶切，并添加了一系列的药物浓度处理来寻找随着药物浓度增加而变化的差异蛋白，增加结合位点鉴定的准确性。由于活细胞受药物处理后容易引起下游信号通路改变从而引起一系列相关蛋白的变化，因此作者选择细胞裂解产物进行LiP-Quant检测。为了进一步降低靶标分析的假阳性率，Biognosys基于机器学习算法提出了LiP-Quant score权重打分体系。

在Hela裂解液DIA检测的结果中，LiP-Quant得分最高的差异肽段有5条来自于FKBP1A，成为最显著的结合候选蛋白，与实际情况完全相符。在酵母的测试中，同样最高得分为已知的雷帕霉素靶标蛋白FRP1。

Biognosys又测试了一种已知的激酶抑制剂：星形孢菌素，该抗生素能够广泛抑制激酶活性。Biognosys采用TPP（热转变蛋白质质谱分析）和Kinobeads pulldown方法和LiP-Quant进行了对比测试。由于该抑制剂可能结合多种不同细胞定位的激酶，在该实验中，额外对膜蛋白进行了针对性提取。从结果发现，三种方法由于针对的蛋白性质完全不同，发现的靶标蛋白一致性较低。

接下来Biognosys测试了一系列疾病治疗中使用的靶向药。治疗卵巢癌的MEK抑制剂司美替尼的实验中验证了其靶向MAPK2K1和MAP2K2的结果，同时也发现其脱靶结合蛋白NQO2。在海绵诱癌素的实验中，也验证了其靶向的PP2A/B和PP1蛋白。

最后，Biognosys将LiP-Quant技术应用在一种未知靶标蛋白的抗菌素BAYE-004的研究中，成功发现了潜在的靶标蛋白Bcin06g02870和Bcin16g04330。并采用了CETSA方法进行了确证。

蛋白质组方面的具体技术路线简述如下（小分子处理步骤略）：

1.蛋白限制性酶切：Proteinase K处理后淬灭；

2.变性酶切：还原烷基化后肽链内切酶孵育2小时，再trypsin酶切过夜，除盐；

3.High pH反相色谱分离10-12个fraction；DDA采集,HF/HF-X C18反相色谱质谱检测；

4.DIA检测：加入iRT后，采用HF/HF-X C18反相色谱检测，2小时/3小时梯度；

5.数据分析：DIA数据采用Spectronaut分析，基本参数均为内置默认参数。DDA数据采用SpectroMine分析，也均为默认参数。除了酶切设置为Trypsin的半酶切。

6.结果过滤：Biognosys针对该类型实验编写了一套机器学习算法，针对目标肽段定量结果进行打分。通常采用>2.5分且为最高得分肽作为阳性结果。

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