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title: "Nature Commun最新，Spectronaut软件针对pSILAC数据分析的具体操作逻辑"
author: "omicsolution.com"
account: "omicsolution.com"
published_at: "2025-06-21T08:39:00+08:00"
captured_at: "2026-08-26T17:18:00.854008+08:00"
source_url: "https://mp.weixin.qq.com/s/gRRsqOHNdUqN6VTd-3yQjQ"
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# Nature Commun最新，Spectronaut软件针对pSILAC数据分析的具体操作逻辑
![图片 1](images/001.png)

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背景介绍

今天广泛使用的蛋白质组实验，往往只能捕捉细胞某一时刻的静态快照，但真实细胞中蛋白质却始终处在不停地合成与降解的流动过程中。如何精准捕捉这种动态变化？

脉冲稳定同位素标记（pulse-SILAC，pSILAC）能在特定时刻向细胞培养基中加入带有稳定同位素标记的氨基酸，让新合成的蛋白质具有“重”标记，而原有蛋白质保持“轻”标记，从而明确区分新旧蛋白质，测量蛋白质的动态周转。

pSILAC数据最突出的特点是每个时间点都同时包含两套肽段信号（即“轻”和“重”同位素信号）。不同于传统蛋白质组实验数据的单通道、静态特性，pSILAC数据随标记时间动态变化：

在标记初期，原有的“轻”肽段信号占据绝对优势，而新合成的“重”肽段信号微弱甚至缺失；随标记时间延长，“重”肽段逐渐成为主导信号，而“轻”肽段信号显著下降。

这种动态、不对称的双通道信号给数据分析带来了特殊挑战，需要在算法设计上特别优化。Spectronaut软件正是因为具备出色的双通道信号提取能力和精确定量优势，成为pSILAC数据分析中的主流选择。

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近期，耶鲁大学医学院刘延盛教授团队在《Nature Communications》发表A robust multiplex-DIA workflow profiles protein turnover regulations associated with cisplatin resistance and aneuploidy的研究，详细阐述了基于Spectronaut的pSILAC数据分析流程。在附件中公开了软件具体参数与每一步的设置逻辑，提供了难得的实践经验。

我们特意将其整理，以便国内研究人员快速掌握这一经典分析策略，更精准地应用于自己的研究工作。

![图片1.png](images/002.png)

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0 1

启动分析

0 1

文件导入和谱库选择

启动directDIA分析，选择质谱数据文件（支持.d或.raw格式）。

![图片 3](images/003.png)

选择对应的蛋白序列数据库（FASTA文件）

![图片 4](images/004.png)

0 2

搜索参数设定 (Pulsar Search)

同位素标记设置：在Labeling标签中明确指定标记类型，如Channel 1为无标记，Channel 2为Arg10、Lys8

![图片 5](images/005.png)

缺失通道生成(In-Silico Generate Missing Channels)：在Workflow标签中启用此选项

![图片 6](images/006.png)

碎片离子过滤(Fragment ion filtering)：在Result Filters标签中选择Overlapping between Channels时，共享的碎片离子完全排除用于鉴定与定量；若未勾选则共享碎片仅在定量时排除（鉴定是保留的）。此选项对后续特定通道FDR过滤（如Min Q-value和Max Q-value）关键。

![图片 7](images/007.png)

0 3

DIA分析设定 (DIA Analysis)

3.1定量过滤(Quantification filtering)

可选“Group Q-value”（推荐默认）、“Min Q-value”、“Max Q-value”或“ChannelQ”。

“Group Q-value” 为跨通道综合评分；“Min Q-value” 至少一个通道需通过q < 0.01；“Max Q-value” 所有通道均需通过q < 0.01。

“Cross-run normalization” 使用所有通道之和推荐开启以稳定通道间差异。

“Exclude All Multi-Channel Interferences” 必须开启，以排除干扰离子（如pSILAC中的b离子）。

“Minimum Log2 intensity” 推荐设定值为3，用于排除极低的定量值。

![图片 8](images/008.png)

3.2工作流定义(Workflow)

在“Workflow”设置中选择“From Library Settings”以自动继承前一步设定（例如“Labeled” workflow）。

![图片 9](images/009.png)

0 4

实验条件定义 (Condition setup)

可为数据后续分析定义条件（Conditions）和颜色（Colors），便于结果可视化与后续分析。此设置可在分析后阶段修改。

![图片 10](images/010.png)

0 5

启动分析 (Start analysis)

选择好所有参数后启动分析。

![图片 11](images/011.png)

0 2

Spectronaut的可视化功能

分析完成后，Spectronaut提供以下多通道数据质控的可视化功能：

Scoring Weight per Channel Plot

显示每个通道在不同样品和时间点上的得分权重。

位置：Post Analysis→ Scoring Histograms。

![图片 12](images/012.png)

H/L Ratios Boxplot

显示每个样品和时间点的H/L比值分布，快速质控整体标记效率。

位置：Post Analysis→ SILAC H/L Ratios。

![图片 13](images/013.png)

H/L Cross Run Ratios Plot

对单个蛋白质的轻重通道强度绘制线性拟合，斜率即代表蛋白H/L比值。可进行过滤或手动挑选前体进行定制化分析。

位置：Analysis标签，选具体蛋白，在Across Runs选项卡内选择H/L Cross Run Ratios Plot。

![图片 14](images/014.png)

0 3

Spectronaut输出结果与后续分析

Spectronaut分析完成后提供以下主要输出供后续工具（如KdeggeR）使用：

导出用于KdeggeR的数据：

要包含前体唯一ID列（EG. PrecursorId）与PG唯一ID列（PG. ProteinGroups）；

要导出轻信号（EG. Channel1Quantity）与重信号（EG. Channel2Quantity）。

导出特定通道q-value以便自定义过滤：

EG.Qvalue（elution group整体的q值）；EG.Channel1Qvalue 和 EG.Channel2Qvalue（单独通道的q值）；EG.MinChannelQvalue 和 EG.MaxChannelQvalue（进一步通道过滤的q值）。

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最后

以上，我们梳理了Spectronaut在脉冲SILAC（pSILAC）数据分析每一步的具体操作逻辑。原文及其附件公开了详细的分析流程和软件参数设定，我们特此进行了中文整理与归纳，以方便国内研究人员更好地掌握和应用pSILAC技术。

如需了解更多细节或引用原始数据，请参考原始文献（见文末）。希望能够为大家解决pSILAC数据分析中的实际难题，更为各位的蛋白质组学研究增添新的助力与灵感。

![图片 15](images/015.png)

![图片 16](images/016.png)