今天广泛使用的蛋白质组实验，往往只能捕捉细胞某一时刻的静态快照，但真实细胞中蛋白质却始终处在不停地合成与降解的流动过程中。如何精准捕捉这种动态变化？
脉冲稳定同位素标记（pulse-SILAC，pSILAC）能在特定时刻向细胞培养基中加入带有稳定同位素标记的氨基酸，让新合成的蛋白质具有“重”标记，而原有蛋白质保持“轻”标记，从而明确区分新旧蛋白质，测量蛋白质的动态周转。
pSILAC数据最突出的特点是每个时间点都同时包含两套肽段信号（即“轻”和“重”同位素信号）。不同于传统蛋白质组实验数据的单通道、静态特性，pSILAC数据随标记时间动态变化：
在标记初期，原有的“轻”肽段信号占据绝对优势，而新合成的“重”肽段信号微弱甚至缺失；随标记时间延长，“重”肽段逐渐成为主导信号，而“轻”肽段信号显著下降。
这种动态、不对称的双通道信号给数据分析带来了特殊挑战，需要在算法设计上特别优化。Spectronaut软件正是因为具备出色的双通道信号提取能力和精确定量优势，成为pSILAC数据分析中的主流选择。
近期，耶鲁大学医学院刘延盛教授团队在《Nature Communications》发表 A robust multiplex-DIA workflow profiles protein turnover regulations associated with cisplatin resistance and aneuploidy 的研究，详细阐述了基于Spectronaut的pSILAC数据分析流程。在附件中公开了软件具体参数与每一步的设置逻辑，提供了难得的实践经验。
我们特意将其整理，以便国内研究人员快速掌握这一经典分析策略，更精准地应用于自己的研究工作。
启动directDIA分析，选择质谱数据文件（支持.d或.raw格式）。
选择对应的蛋白序列数据库（FASTA文件）
同位素标记设置：在Labeling标签中明确指定标记类型，如Channel 1为无标记，Channel 2为Arg10、Lys8
缺失通道生成(In-Silico Generate Missing Channels)：在Workflow标签中启用此选项
碎片离子过滤(Fragment ion filtering)：在Result Filters标签中选择Overlapping between Channels时，共享的碎片离子完全排除用于鉴定与定量；若未勾选则共享碎片仅在定量时排除（鉴定是保留的）。此选项对后续特定通道FDR过滤（如Min Q-value和Max Q-value）关键。
3.1 定量过滤(Quantification filtering)
可选“Group Q-value”（推荐默认）、“Min Q-value”、“Max Q-value”或“ChannelQ”。
“Group Q-value” 为跨通道综合评分；“Min Q-value” 至少一个通道需通过q < 0.01；“Max Q-value” 所有通道均需通过q < 0.01。
“Cross-run normalization” 使用所有通道之和推荐开启以稳定通道间差异。
“Exclude All Multi-Channel Interferences” 必须开启，以排除干扰离子（如pSILAC中的b离子）。
“Minimum Log2 intensity” 推荐设定值为3，用于排除极低的定量值。
3.2 工作流定义(Workflow)
在“Workflow”设置中选择“From Library Settings”以自动继承前一步设定（例如“Labeled” workflow）。
可为数据后续分析定义条件（Conditions）和颜色（Colors），便于结果可视化与后续分析。此设置可在分析后阶段修改。
选择好所有参数后启动分析。
分析完成后，Spectronaut提供以下多通道数据质控的可视化功能：
Scoring Weight per Channel Plot
显示每个通道在不同样品和时间点上的得分权重。
位置：Post Analysis → Scoring Histograms。
H/L Ratios Boxplot
显示每个样品和时间点的H/L比值分布，快速质控整体标记效率。
位置：Post Analysis → SILAC H/L Ratios。
H/L Cross Run Ratios Plot
对单个蛋白质的轻重通道强度绘制线性拟合，斜率即代表蛋白H/L比值。可进行过滤或手动挑选前体进行定制化分析。
位置：Analysis标签，选具体蛋白，在Across Runs选项卡内选择H/L Cross Run Ratios Plot。
Spectronaut分析完成后提供以下主要输出供后续工具（如KdeggeR）使用：
导出用于KdeggeR的数据：
要包含前体唯一ID列（EG. PrecursorId）与PG唯一ID列（PG. ProteinGroups）；
要导出轻信号（EG. Channel1Quantity）与重信号（EG. Channel2Quantity）。
导出特定通道q-value以便自定义过滤：
EG.Qvalue（elution group整体的q值）；EG.Channel1Qvalue 和 EG.Channel2Qvalue（单独通道的q值）；EG.MinChannelQvalue 和 EG.MaxChannelQvalue（进一步通道过滤的q值）。
以上，我们梳理了Spectronaut在脉冲SILAC（pSILAC）数据分析每一步的具体操作逻辑。原文及其附件公开了详细的分析流程和软件参数设定，我们特此进行了中文整理与归纳，以方便国内研究人员更好地掌握和应用pSILAC技术。
如需了解更多细节或引用原始数据，请参考原始文献（见文末）。希望能够为大家解决pSILAC数据分析中的实际难题，更为各位的蛋白质组学研究增添新的助力与灵感。
