胰腺癌（Pancreatic Cancer）又被称作“癌症之王”，其常见类型90%为胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）。PDAC是最致命的实体恶性肿瘤之一。目前，由于缺乏有效的疾病筛查，且PDAC症状难以捉摸，因此大多数患者在诊断时已处于晚期。
目前的治疗难题是： 对于可切除的胰腺导管腺癌（PDAC）患者，虽然辅助化疗是首选的治疗方案，但其在两年内的高复发率（69%-75%）仍是一个严峻挑战。为了提高治疗效果，近年来有研究尝试在手术前先行新辅助化疗，目的是减小肿瘤体积，增加根治性手术的成功率。然而，这种方法对于化疗不敏感的患者来说，可能导致肿瘤进展，错失手术治愈的机会。在这种情况下，准确地分层患者，以便为他们提供个性化的治疗方案变得尤为关键。虽然通过基因组和转录组数据分析已经揭示了分子分型对于PDAC治疗方案和预测治疗反应的实用性，但要全面理解PDAC并优化治疗策略，还需要融合蛋白质组学数据。2024年1月29日，上海交通大学医学院附属瑞金医院胰腺中心-上海市胰腺肿瘤转化研究重点实验室沈柏用教授，转化医学国家重大科技基础设施（上海）陈赛娟院士、方海教授、印彤教授的合作团队，在Nature Medicine上发表了题为“Prospective observational study on biomarkers of response in pancreatic ductal adenocarcinoma”的研究论文。该团队开展了一项前瞻性观察研究，招募了 1,171 名接受胰腺切除术的 PDAC 患者，随机对 191 个患者的显微切割样本进行蛋白质组学分析，揭示了临床相关的功能蛋白模块。并为PDAC建立了一个蛋白质组学水平的预后风险模型，并使用国际外部队列进一步验证了该预后模型的有效性和可靠性。更重要的是，该团队利用临床和蛋白组学数据开展了交互作用回归分析，发现了两种可用于预测PDAC患者对辅助化疗敏感性的生物标志物，NDUFB8和CEMIP2。这两个新型蛋白标记物通过免疫组化在内部和外部队列中均得到验证。
手术切除原发胰腺导管腺癌（PDAC）组织和癌旁（TAT）组织，TAT距肿瘤边缘3cm。在瑞金医院诊断并接受胰腺切除术的1171名中国PDAC患者（称为RJ-队列)，从中随机挑选191名患者，作为发现队列——RJ-队列1（n=191），RJ和RJ-队列1的基线特征相似。RJ-队列中另两个独立的内部队列——RJ-队列2（n=50）和RJ-队列3（n=386），来自上海和法国的多中心队列——SH-队列（n=466）和FR-队列（n=230）。DIA定量蛋白质组分析：RJ-队列1收集的191例PDAC肿瘤组织和90对TAT组织。PRM靶向蛋白组验证：RJ-队列2收集的50例PDAC肿瘤组织。IHC扩大验证：RJ-队列3收集的386例PDAC肿瘤组织者；SH-队列（n=466）；FR-队列（n=230）Kaplan-Meier生存曲线比较RJ-队列患者的总生存期，结果发现接受辅助化疗的患者显示出优于未接受辅助治疗的患者的总生存期（OS）结局。
为了阐明总生存期（OS）差异的分子机制，作者对191例患者（RJ-对列1）进行了蛋白质组分析，旨在预测辅助化疗的预后和结果。
LC-MS/MS采集：首先对混合样本进行DDA采集构建谱图库；然后对每例样本进行DIA模式采集，上机时长120min。数据库搜索：使用Spectronaut 15.1软件（Biognosys）中的Pulsar搜索引擎搜索所有DDA数据，随后对所有DIA数据也通过Spectronaut进行分析，默认参数。对胰腺导管腺癌(PDAC)和相邻组织（TAT）的DIA定量蛋白质组比较，鉴定出7881个蛋白质，平均每个样本鉴定到6075个蛋白质。通过数据预处理、主成分分析(PCA)、差异蛋白筛选和火山图分析，发现1213个蛋白在肿瘤中上调（p＜0.05 & FC＞1.5），864个下调。
利用WGCNA分析识别出32个功能模块，这些模块与临床数据的关联分析揭示了与肿瘤转移、预后相关的蛋白模块。部分上调模块与患者的总生存期(OS)显著相关，比如ME24和ME26与较差的OS相关，而ME10和ME11与较好的OS和无病生存期(DFS)结局相关。
上述蛋白质组分析确定了PDAC中激活的通路以及与临床相关的功能模块。虽然ME24、ME26、ME10和ME11等模块与OS和DFS相关，但这些模块均包含超过100种蛋白质，使其在临床环境中难以实施。因此接下来需要有效地缩小蛋白数量。
方法：在RJ-队列1中，基于上述识别的32个功能模块蛋白，研究进一步通过LASSO-Cox回归分析建立PDAC的预后风险模型。LASSO模型：根据LASSO评分将患者进行排序，并以评分的中位数将患者分层。比较不同分层患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）。模型蛋白分析：将LASSO模型中的蛋白映射到上述WGCNA功能模块网络图中。相关性分析：采用Spearman相关分析计算P值，比较LASSO评分和32个模块评分之间的相关性。验证模型性能：使用外部和内部队列进行交叉验证，外部PDAC队列来自临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（CPTAC）数据集中的Cao et al.队列。另一个独立的内部队列为RJ-队列2（n=50），利用PRM靶向蛋白组分析方法，对每例PDAC患者冷冻肿瘤组织的模型蛋白进行定量分析，根据LASSO评分中位数将患者分层，并比较评分高/低的患者的总生存期（OS）。LASSO模型：模型中筛选到adjusted P＜0.01的14个差异蛋白，根据LASSO评分将PDAC患者分层为两组，即“评分高”和“评分低”，高评分患者预后较差。模型蛋白分析：LASSO模型中的这14个蛋白均匀分布在8个功能模块中。相关性：LASSO评分与6个模块均显示出显著相关性(adjusted P＜0.05, Spearman相关)。验证模型性能：Cao et al.队列和RJ-队列2均显示LASSO评分的成功分层，验证了回归模型中鉴定出的14种蛋白的预后功效。考虑到PDAC切除术后辅助化疗的显著生存获益，接下来整合了临床和蛋白质组学数据集，以确定指示PDAC辅助化疗应答的蛋白质组学生物标志物。
筛选方法：采用Cox比例风险模型，该模型将化疗-蛋白标志物交互作用项纳入了OS。根据风险比值（HR）和p-value，筛选出辅助化疗的有利（log2(HR)＜0 & P＜0.05）和不利（log2(HR)＞0 & P＜0.05）蛋白质组学标志物。该分析确定了排名前两位的生物标志物，NDUFB8和CEMIP2，显示出与化疗显著相关。多变量分析进一步证实了这些发现。分子背景：NDUFB8是一种线粒体呼吸链复合物I蛋白，对氧化能量代谢至关重要，在PDAC中表达下调。相反，编码细胞表面透明质酸酶的CEMIP2，负责将高分子量的透明质酸分解为低分子量的透明质酸，在肿瘤中上调。预后：NDUFB8和CEMIP2这两种生物标志物的蛋白丰度在不同化疗方案的患者中有显著差异。- 化疗显著延长NDUFB8低丰度患者的OS，而在NDUFB8丰度高的患者中，其获益不太明显。
- 相反，CEMIP2水平较高的患者显示出更好的OS。并且在根据CEMIP2表达高/低分层的两组中，化疗均延长了OS。
- 这两种生物标志物可以预测PDAC患者的辅助化疗敏感性。
- 此外，无论这两种蛋白表达高/低的患者亚组，都提示辅助治疗具有更好的OS，尤其是CEMIP2，辅助治疗可改善CEMIP2低表达组和CEMIP2高表达组患者的生存。
进一步，两种标志物在内部和外部队列通过IHC染色验证与蛋白组结果一致。在“RJ-cohort 3”中，NDUFB8低表达分层患者（HR = 1.826, 95% CI = 1.086–3.070, P = 2.31 × × 10−2）或CEMIP2高表达分层患者（HR = 0.573, 95% CI = 0.343–0.957, P = 3.32 × × 10−2）对辅助化疗更敏感，OS结局更好，在另外两个队列结果是类似。
1）本研究发现了两种蛋白质组学生物标志物（NDUFB8和CEMIP2），它们有效预测PDAC患者对辅助化疗的反应。适合接受一线化疗的患者优先考虑辅助化疗，而这两种蛋白质组学生物标志物能够为患者和医疗团队提供个性化化疗的重要信息。这个研究开启了通过临床蛋白组学指导患者治疗的先河。2）团队自主建立了交互式的网站（http://www.genetictargets.com/pdac2），共享了原始数据、代码和资源，研究者可以参考该研究的思路和方法，深入学习临床蛋白组整合分析方法。3）利用DIA质谱技术结合Spectronaut软件解析，本研究在患者样本中高效鉴定出将近八千种蛋白，平均每个样本分析出六千多种蛋白。该方法不仅展示了对大规模样本的高通量分析能力，还保证了生物标志物发现与验证的高准确性和可靠性。揭示了肿瘤生物学的关键路径，为PDAC的分子机制研究和精准治疗提供了坚实的科学基础。
DIA+Spectronaut（DIA分析软件）+PRM是发现并验证蛋白质标志物的“黄金搭档”：如果您有≥20例样本，我们肯定推荐您做DIA定量蛋白组，样本越多越推荐。为什么这么说呢？20例样本哪怕采用TMT-18标，也要分两组，标记起来也很麻烦，而且为了增加鉴定量，临床样本通常会进行大量分级，这样需要蛋白量充足，假如每标记组分20级，总共就要上机40次，并且DDA模式的鉴定深度和稳定性一直不如DIA。而且目前DIA数据解析的专业分析软件Spectronaut 18（Biognosys）基于深度学习算法，可以无需额外构建建库，直接定量DIA数据，降低了成本。因此，对于临床大队列蛋白组研究，选择DIA技术，在稳定性、覆盖度、节约样本量和性价比方面尽显优势。
对于DIA技术：易算生物一直致力于自主研发或引进国际先进蛋白质组学产品，包括试剂盒、蛋白前处理工作站、Spectronaut数据分析软件独家代理等，开发围绕大队列、自动化、高灵敏的蛋白质组学检测方案，从蛋白前处理、色谱分级和数据解析等全方面推动临床大队列蛋白组研究的通量、速度、重复性飞跃。最近，我们在150例临床组织样本进行了测试：采用易肽Auto100全自动工作站结合易肽试剂盒两天完成蛋白前处理；质谱上机采用短梯度快速DIA定量；Spectronaut软件分析，一周左右完成分析。定量到约9000个蛋白Groups，最重要的是，从Spectronaut分析的蛋白定量热图来看，DIA定量的数据很稳定，缺失值少。总定量蛋白数和平均定量蛋白数以及缺失值比例都令人满意，从而能够挖掘更多有价值的信息。
PRM技术的关键作用：在此研究中，质谱（PRM）技术以高灵敏度和特异性在验证预后风险模型相关蛋白质方面发挥了核心作用。
对于大队列样本的PRM靶向蛋白组定量，我们也建立了一套自动化方案：首先，我们利用最前沿的蛋白提取策略，代理或开发了多种试剂盒，包括易肽系列、PreOmics iST和Biognosys，结合蛋白自动化前处理工作站，保证样本质量的一致性和可比性。此外，针对谱图库当中没有的蛋白，也可以通过易算DeepPRM平台来找蛋白，该平台基于谱图深度学习预测目标蛋白的肽段可检测性以及保留时间，增加PRM的覆盖率、节约成本。对于PRM的数据分析，我们代理了Biognosys开发的SpectroDive软件，该软件拥有目前最智能化的谱峰提取算法，并能够实现大规模样品的自动化分析。
总之，针对临床意义的蛋白质标志物的发现与验证，易算生物具备完整的DIA+PRM流程方案，在分析方面，我们根据十多年的经验，部署了各类分析工具包，从蛋白质Biomarker的识别、分子特征分析到蛋白-临床-多维度信息整合。为您的后续数据分析提供指导，以延伸您的发现。
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