Science 子刊 | 结直肠癌研究 | 磷酸化蛋白质组学互补视角解析EGFR抑制剂的敏感与耐药相关标志物
文章题目：Phosphoproteomics of patient-derived
xenografts identifies targets and markers associated with sensitivity and
resistance to EGFR blockade in colorectal cancer
文章价值
基于质谱的分析发现CS（敏感组）和CR（耐药组）肿瘤之间存在的磷位点和蛋白质差异，成功地鉴定出了关键的超活性激酶，并进一步锁定了针对尚未在基因组上被解释的耐药模型的潜在激酶治疗靶点。蛋白质组与磷蛋白质组为我们展现了互补的视角，二者结合可深入地探讨mCRC肿瘤中药物的敏感性及耐药机制。
文章背景及现状
表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂疗法转移性结肠癌患者的标准治疗方法，这些药物的应用提高了这类患者的响应率和总体生存率。部分对cetuximab和panitumumab的耐药性归因于EGFR下游KRAS、NRAS或BRAF的肿瘤相关突变。
然而遗憾的是，某些患者即使没有EGFR下游的上述提到的特定突变，仍未从这些抗EGFR治疗中获益。
现有的研究和发现
近年来在患者来源的异种移植（PDX）模型上的基因组学研究已为我们揭示了与抗药性相关的多种耐药机制和生物标志物。但是，仅仅看基因可能还不够。蛋白质才是是执行“命令”的那部分，它们决定了细胞的行为。肿瘤的大规模蛋白质组和磷酸化蛋白质组研究也为无靶向突变的肿瘤治疗提供了新的机会。
研究目的与策略
考虑到需要对蛋白质的表达和激活状态有更全面的了解，本研究采用了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的方法来进行综合分析。尤其考虑到酪氨酸在癌症增长中起到了关键作用，为进一步深化对酪氨酸激酶抑制剂的响应机制的认知，专门采纳了基于酪氨酸的磷酸化蛋白质组学方法。值得一提的是，这种策略已被先前的研究验证在临床背景中对于微量的肿瘤组织也有效。
文章结合质谱的蛋白质组学技术以及基于TiO2和pTyr的磷酸化蛋白质组学技术，对30个经过基因组鉴定，对cetuximab具有反应性的mCRC-PDX肿瘤进行分析，以深化对mCRC中cetuximab这个EGFR抑制剂敏感性和抗性机制的理解，还为识别个别肿瘤的潜在治疗策略提供了有力线索。
结果1、样本分组与差异比较
使用了10个对西妥昔单抗(cetuximab)敏感(CS)和20个对其耐药(CR)的异种移植瘤样本。
CS vs. CR-ALL: 这是对所有对西妥昔单抗敏感的模型（CS，Cetuximab-Sensitive）和所有对西妥昔单抗耐药的模型（CR-ALL，Cetuximab-Resistant All）的比较。
CS vs. CR-WT: 这是敏感模型和那些对西妥昔单抗耐药且在Ras/Raf上没有突变的模型（CR-WT，Cetuximab-Resistant Wild Type）之间的比较。
CS vs. CR-MUT: 这是敏感模型和那些对西妥昔单抗耐药且在Ras/Raf上存在突变的模型（CR-MUT，Cetuximab-Resistant Mutated）之间的比较。
文章对差异磷酸化位点的数量、差异蛋白质的数量各自进行统计。尤其通过聚类发现差异性磷酸化位点的特点和差异蛋白的特征分别是：
在敏感肿瘤中，pTyr标记的磷酸化明显增加；而基于TiO2的标记主要揭示了在耐药肿瘤中的增多的磷酸化位点。此外，基于TiO2的磷酸化标记也进一步区分了CR-MUT和CR-WT肿瘤。
蛋白质表达差异：蛋白质表达数据可以区分敏感和抵抗的肿瘤，这两类肿瘤中表达高的蛋白质数量相近。
结果2、网络分析
展示了与cetuximab（一种EGFR抑制剂）敏感性和抵抗性相关的蛋白质之间的相互作用网络。揭示了在结直肠癌中可能的关键信号通路和作用蛋白，为进一步的研究和治疗提供了线索。
具体采用的数据是：首先将所有三种比较（即CS与CR-ALL、CR-MUT或CR-WT的比较）的差异性(protein and phosphoprotein)数据整合在一起。当存在重叠时，他们选择了具有最大变化倍数（Fold Change，简称FC）的比较结果。
接下来基于mRNA的注释：使用完整的PDX群体（即157个CS和246个CR的PDX肿瘤，简称为RNA400）以及本研究中使用的子集模型（简称为RNAsub）的mRNA表达数据，进一步为蛋白质注释。
然后形成生物学上相关的蛋白质簇：利用Markov聚类和Gene Ontology分析，研究者识别出了8个具有生物学意义的蛋白质簇。有哪些规律？
与cetuximab敏感性相关的特征：
“细胞-细胞连接组织”簇：这个簇包括了一些关键的细胞-细胞粘附分子，特别是CXADR、claudin 1和3。
“核糖核蛋白复合体生物生成”簇：这个簇中含有多种与核糖体生物合成相关的蛋白质，如BOB1、DDX27、DDX28、RRS1、DKC1、RCL1、NPM1和RSL1D1。这可能暗示这一途径在药物敏感性中扮演了角色。
在两个RNA数据集（RNA400和RNAsub）中，CS模型中CXADR的表达都有显著的增加，这进一步强调了其在cetuximab敏感性中的重要性。
与cetuximab耐药性相关的特征：
“酶联受体蛋白信号传导”簇：这个簇涉及了与AKT1信号有关的蛋白质。已经有研究指出PI3K-PTEN-AKT信号轴在EGFR抑制剂的抵抗中起了关键作用。
“1型干扰素信号”簇：这个簇与cetuximab的抵抗性有较强的相关性，可能涉及一些特定的免疫应答机制。
除上述簇外，图2中还强调了一个特定的蛋白质——KIAA1522。尽管KIAA1522的功能尚不明确，但其在非小细胞肺癌中的高表达与不良预后有关，这可能意味着它在cetuximab的抵抗中可能有关键作用。
结果3、GSEA分析、PTM-SEA分析
蛋白组GSEA分析揭示了与cetuximab敏感性和耐药相关的生物学过程的富集模式，这些富集模式在不同的分子层面上可能有所不同。
比如在CS肿瘤中的富集结果发现氧化磷酸化 (OXPHOS)仅在蛋白质水平上揭示的富集过程，为最显著的富集条目之一；Myc targets和脂肪生成(adipogenesis)：这两个过程也在RNA水平上被捕捉到；在CR肿瘤中的富集结果发现，上皮-间质转化 (EMT)在RNA和蛋白质水平上都表现出强烈的富集，而干扰素反应相关条目仅在蛋白质水平上揭示的富集过程。
而对于磷酸结果，采用PTM-SEA专门用于评估磷酸化位点的特定富集，这有助于解析细胞信号转导和功能，尤其是通过PTM-SEA展示了与敏感性和耐药相关的磷酸化位点富集特征。
结果4、INKA分析
INKA是一个基于激酶的磷酸化和其相应底物的定量分析工具，用于评估各样本中的激酶活性。INKA分析为研究者提供了一种功能性方法来确定在抗EGFR治疗中可能发挥关键作用的蛋白激酶。
INKA（激酶活性分析）在本文中是一个关键的工具，用于识别潜在的异常活跃的激酶，这些激酶可能与药物（例如cetuximab）的耐药性有关。INKA能为研究者提供深入的洞察，揭示患者在特定治疗下可能失败的原因，并为其他治疗目标提供新的选择。
本文中，INKA的特定应用如下：
鉴定耐药性机制：通过对PDX模型CRC0161和CRC0166的基因组分析，没有发现能解释其对cetuximab的抵抗性的致癌驱动变异。因此，根据它们的INKA概况，选择了这两种模型进行功能实验和药物筛选。
INKA分析的结果：在两种模型中，INKA分析指出了EGFR、EPHA2、多种其他ephrin受体以及Src家族酪氨酸激酶的高活性（如图A所示）。此外，以前的研究已经暗示EPHA2与gefitinib抵抗的HCC827细胞中的EGFR抑制抗性有关。
寻找潜在治疗目标：图6的INKA分析提供证据显示dasatinib（一种药物）可能是有效的治疗选项，因为它是ephrin家族激酶，特别是EPHA2的强效抑制剂，同时也抑制Src家族激酶，且在高纳摩尔范围内抑制EGFR。根据这一点，选用了dasatinib来测试这些激酶作为另一种治疗靶标的潜力。
文章读后总结
1）研究结论并不倾向于单一因子决定性地预测肿瘤治疗反应。实际上，多组学数据揭示，肿瘤治疗的积极反应是由一系列分子特征共同决策的。因此，在预测治疗效果时，全面考虑是关键。
2）在对单一样本进行激酶活性分析时，ERBB2、EGFR和MET被鉴定为西妥昔单抗耐药的关键驱动激酶。CR-PDX肿瘤在激酶抑制剂与西妥昔单抗的联合治疗下表现出明显的反应。后续INKA分析专注于两个EGFR活跃异常的PDX模型（CRC0161和CRC0166）。除了EGFR，INKA数据还揭示了EPHA2、多个肝配体受体及Src家族酪氨酸激酶的活跃性。考虑到达沙替尼可有效抑制这些激酶，研究进一步探索了它对这些激酶的潜在治疗效果。显著地，达沙替尼与低剂量的西妥昔单抗联合使用，与单独治疗相比，显著降低了CRC0161肿瘤的活性。
这进一步凸显了结合激酶活性评估的磷酸化蛋白组学在指导精准医学治疗中的关键作用。
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