最近几年我们一直在强调DIA蛋白质定量上的卓越性能，但似乎很少有人会直接采用DIA方法进行蛋白质的定性分析。我们都知道定量其实都要基于定性证据再计算的。那为何定性本身不用DIA呢？其实这是个思维惯性问题。今天我们就为大家介绍下基于Spectronaut的多个样品定性DIA分析流程及与DDA分析结果的对比。
为了让您先入为主的了解DIA相对DDA检测的优势，我们先上测试对比结果。
本次测试选择小鼠细胞培养基分泌蛋白作为测试对象。我们都知道如果做培养基分泌蛋白时，需要在收集前换成无血清培养基方能避免胎牛血清的高丰度蛋白干扰。但是在无血清培养时细胞处于饥饿应激状态，可能无法完全反映细胞分泌蛋白的真实状况。而如果采用正常血清培养基体系的话，结果可能会被高丰度的牛血清蛋白所覆盖，导致检测不到多少细胞分泌蛋白。因此我们采用 EasyPept-DeeP低丰度富集前处理试剂盒 进行无偏高丰度蛋白去除后进行对比测试。统一采用1小时梯度的timsTOF Pro2，分别采集去除高丰度和正常含血清培养基，DDA和DIAPASEF轮流采集。无法区分牛还是小鼠来源的蛋白不纳入数量统计和对比（约15%）。Spectronaut 分析DIA数据，Spectromine分析DDA数据。采用相同的PSM,PEP,PG 1% FDR质控。
图1 不同采集模式，去除高丰度结果对比
如图1所示，无论是否去除高丰度蛋白，DIA均比DDA结果有50%以上的数量提升，这也和我们在DIA定量测试中的结果相类似。尤其是去除高丰度后的DIA结果成功定性了3054个纯鼠源分泌蛋白，实现了不进行无血清培养下的极深度分泌蛋白定性。DDA模式下也定性了2032个蛋白，那么DIA定性到底靠谱么？实际上很多文章都已经比较过了多种FDR检验策略来证明DIA的定性可靠性，我们就不再赘述。这里，我们从另一个角度来对比：这几个样品和采集方式的结果一致性。如下图：
图2 2个样品2种采集模式下Protein Group的韦恩图
如图2所示，DIA模式下的去高丰度定性结果占所有样品的总定性结果的97%左右，DDA模式下的去高丰度定性仅额外鉴定了56个蛋白质。可以间接证明DIA采集模式实现了极高比例的定性覆盖。而这样的结果一方面得益于DIA方法无偏采集所有谱图，另一方面也得益于新一代Pulsar的高灵敏算法，使其大大拉开了与不分级DDA间的检测性能差距。
图3A.DIA模式下不去和去高丰度蛋白丰度对比，纵坐标为log2Quantity
图3B.DDA模式下不去和去高丰度蛋白丰度对比，纵坐标为log2Quantity
1.在常规定性蛋白质组研究中DIA方法也同样有着无与伦比的优势，我们可以考虑逐步采用DIA替代DDA进行定性分析；
2.某些特殊场合可能还需要依赖于DDA分析，如多肽组、未知修饰寻找、脱酰胺化检测等；
3.采用易肽低丰度富集策略能够极大提升血清培养基体系下的细胞分泌蛋白检测深度。
其实常规的Spectronaut DIA流程即可完成同样的样品定性、定量分析。
本文将额外介绍下如何批量的进行多个样品的独立定性分析和结果自动化导出。
参数模板：
我们首先需要准备下用于批量导出定性结果的模板文件，以下是我个人推荐的总体分析结果导出和蛋白定性结果导出方法。
切换到Report面板，选择Normal Report，任意选择一个已有模板，去掉Columns列中所有选择项，勾选Experiment，Run两大类所有选项。Filters中勾选No Decoy即可。如下图
我们便可以通过该模板导出各个样品的总体检测结果统计。当然其中部分您不需要的选项自行去除勾选后save as成一个新模板即可。
蛋白定性列表导出只要参考下图，勾选自己需要的类别，仅选择Protein Group分类下的内容即可导出蛋白水平的定性结果报告，同样最后另存为一个新的模板即可。如果需要同时导出蛋白的GO注释，记得Databases面板中导入相应物种的注释数据库。
参数文件设置：
搜库参数需修改DirectDIA，或DIA Analysis（如果已构建谱图库）面板下
1：DIA Analysis的Workflow:Method Evaluation。该选项为可选，如果您希望Spectronaut对单个样品完全独立定性检测，而不需要统一构建谱图库进行深度机器学习提升，那么勾选该选项。
您还需要在后续样品导入设定中为每个样品设定不同的condition分组，如下图：
如果希望采用深度学习构建谱图库来提升鉴定灵敏度，则无需勾选该选项。
2.pipeline mode下勾选刚才设置完毕的report模板，并将Reporting Unit改为Per Run，即可为每个定性样品单独导出结果报告。记得勾选Generate SNE file，这样确保保存了分析结果SNE文件，方便后续单独查看。
设置完毕后save as该模板即可。
打开Pipeline面板，选择DIA analysis或directDIA analysis，导入分析数据即可：
其余设置和平时的DIA分析一摸一样，最后一步选择输出目录，完成后该分析项目便会显示在左侧pipeline Queue等待分析，如果不需要添加更多其他任务，点击Run Pipeline按钮即可开始分析。
分析完毕后查看我们的输出目录即可找到所有自动导出的分析结果和每个单独样品的分析报告
采用Spectronaut pipeline分析模式即可方便快捷的对海量数据进行定性（当然也可以定量）分析。你还不快来试试？
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