Spectronaut 19--PTM数据位点水平信号归一化

全新升级的SN19支持基于参照实验对修饰位点的信号强度进行归一化，不用苦哈哈在表格里拆蛋白了！

步骤入下图：

第一步，对参照实验数据（一般是与翻译后修饰蛋白组同一来源的样本采集的全蛋白质组数据）进行数据检索，检索时注意采用PTM Workflow的参数，可变修饰中将关注的翻译后修饰如磷酸化修饰加入进去，PTM workflow对应的参数“Input Normalization Strategy”以及Stoichiometry Calculation Strategy”都设置为“None”，如下图：

第二步，对PTM原始数据进行检索，参数设置时除了可变修饰需要添加关注的修饰类型之外，在Settings→DIA Analysis→PTM Workflow→[Beta] Input Normalization Strategy下选择对位点进行信号归一化的策略：

此处的参数是基于参照样本中的肽段进行的数据处理，推荐进行修饰组学的同时，同一份样本也做一个不富集的全蛋白质组的参照实验用于对修饰组学的位点水平进行信号归一化。其中：

None：不进行位点水平的信号归一化或者换句话说本底扣除，默认参数设置为None。

None-modifiable peptides：用非修饰肽段计算得出的蛋白定量值进行位点水平的信号强度归一化。

None-modified peptides：用不含当前分析的修饰肽段计算得出的蛋白定量值进行位点水平的信号强度归一化。

All Peptides：用所有鉴定到的肽段计算得出的蛋白定量值进行位点水平的信号强度归一化。

如果需要SN自动用输入的参照实验对修饰位点进行信号强度归一化，则在Settings→DIA Analysis→PTM Workflow→[Beta] Input Normalization Strategy下选择除None之外的参数→Import SNE file（或是在Recent Experiments下选择对应的全蛋白质组结果文件）→双击选中对应SNE file→右侧窗口会自动匹配样本对应关系（右下角会显示match的结果）→如果match有误，也可通过左下角工具栏“Export Sample Linking Setup”导出并编辑样本关联表格（optional）→“Import Sample Linking Setup”导入编辑好的关联表格（optional）→Next

最终修饰位点的定量结果如下（Report--PTM Site Report--Pivort Report导出）：

关键信息如下：

PTM.ProteinId：修饰位点所在的蛋白ID；

PTM.CollapseKey：修饰位点的位置信息，由“蛋白ID_修饰的氨基酸位点_修饰的多态性”组成，所谓修饰的多态性是指该修饰位点对应的多肽序列上除了该位点以外是否还存在其余的n个同类型修饰，如果不存在，M后面的数字即为1，如果存在n个，M后面的数字即为n+1；

PTM.Multiplicity：修饰的多态性，是指该修饰位点对应的多肽序列上除了该位点以外是否还存在其余的n个同类型修饰位点，如果不存在，M后面的数字即为1，如果存在n个，M后面的数字即为n+1；

PTM.ModificationTitle：修饰类型；

PTM.SiteAA：修饰发生的氨基酸；

PTM.SiteLocation：修饰发生的位点信息；

PTM.FlankingRegion：该修饰位点对应的sequence window，默认以修饰位点为中心，前后各保留7个氨基酸；

PG.Quantity：蛋白定量值，该值是由修饰组学检测到的肽段定量值计算而来；

PTM.Group：该位点整合的来源肽段母离子，默认参数下软件会自动将同一个修饰位点对应的不同的肽段母离子的isoform定量值进行加和，作为该位点的定量值（PTM.Quantity）；

PTM.Quantity：无论是否设置Input normalization strategy，此处的定量值都是修饰位点原始定量值，没有采用PG.Quantity或PTM.InputNormalizationFactor进行信号归一化处理的初始值；

PTM.InputNormalizationFactor：用于进行位点信号归一化的归一化系数，该值来源于Input Normalization Strategy下设置的关联蛋白质组的蛋白的PG.Quantity。如果Input的蛋白质组中没有鉴定到这个位点所在的蛋白，则此处显示为NaN；

PTM.QuantityPerProtein：归一化处理后的位点定量值，如果选择的是Input Normalization Strategy则后续进行位点水平的统计分析则基于此列数值进行，该值是由PTM.Quantity/PTM.InputNormalizationFactor计算得出。如果不选则对位点进行归一化处理即Input Normalization Strategy选择None，则该值由PTM.Quantity/PG.Quantity计算得出。