Spectronaut

2024

随着DIA技术的普及，在获得海量、深度覆盖数据的同时，对于挖掘到的数据的验证工作量也随之增加，因此DIA数据与后续PRM/MRM验证工具的兼容性以及结果易用性变得尤为重要，而Spectronaut v19（以下简称SN19）的推出也进一步提升了PRM/MRM方法编辑的便利性。

SN19增加的其中一项功能---directDIA分析结果可直接自动生成谱图库（.kit）文件，该文件可直接导入SpectroDive进行panel的生成和方法的导出。这为我们进行靶向方法的建立提供了更为便捷的途径。

接下来我们就通过具体的示例来为大家演示操作流程：

第一步：在分析DIA数据的前期，先勾选一个参数，如下图（Settings---Global---Reporting---Generate Library from directDIA）：


勾选上该参数之后，directDIA分析完成之后的结果就会自动生成一个谱图库文件，我们在Library界面下即可查看到，如下图所示：


该谱图库可以导入到SpectroDive进行panel的创建和方法编辑。

此外，如果我们将Spectronaut和SpectroDive软件中谱图库存储设置在同一路径下的话，两个软件中的谱图库文件即可以共用，设置方法如下图所示，即将SN和SD中的Settings--Global--Directories--Spectral Library Storage点击“Browse”指定到同一路径下（PS：设置完记得重启一下软件）


之后，我们在SpectroDive 的Library界面下就可以看到Spectronaut生成的谱图库文件。

第二步，基于谱图库文件进行Panel的创建，具体流程如下：


Prepare--Generate New Panel--选中要使用的Library--Next。


在右侧Filter窗口键入目标蛋白ID，左侧是自动匹配ID进行过滤，ID匹配完成之后点击左下角“Check All”按钮即可选中所有谱图库中存在的目标蛋白。

接下来就是针对目标蛋白挑选符合条件的肽段进行靶向采集，主要的限定条件可通过右侧Filter窗口进行设置，同样左侧会根据设定的条件自动过滤符合条件的肽段。


特此附上目标肽段挑选的一般原则：

  1. proteotypic peptides，目标蛋白特有的肽段（Protein Group Specific，Proteotypic概念还是没有很明确，参见往期推文：https://mp.weixin.qq.com/s/bKAbdZ5ve-m3mV9Kw_apVQ）；

  2. 无翻译后修饰，还原烷基化除外；

  3. 肽段长度：8-25个氨基酸；

  4. 无漏切位点，精氨酸和赖氨酸的C端是脯氨酸视情况自行决定；

  5. 带电荷，挑选2-3电荷的肽段；

  6. 信号强度。挑选碎裂效率高，信号较强的肽段；

  7. 不含脯氨酸（P）。如果目标肽段中含有脯氨酸，那么肽段在脯氨酸N端碎裂时产生的碎片离子信号强度极强，会抑制其他碎片离子的强度，因此不建议挑选；

  8. 去除包含容易发生修饰的氨基酸的肽段，例如甲硫氨酸（M）和色氨酸（W）容易发生氧化，谷氨酰胺（Q）和天冬酰胺（N）容易脱酰胺（deamidation），N末端的谷氨酸（E）和谷氨酰胺容易环化。以及丝氨酸、苏氨酸等易发生磷酸化的，N-X-S/T（N端糖基化），乙酰化等。半胱氨酸除外，虽然会发生还原烷基化但是在所有样品中都是可重复的，发生的概率一致，因此，包含半胱氨酸的肽段不用排除；


以上条件并非全部都要满足，可根据情况适当放宽。

目标肽段选择好之后，进一步选择用于定量的碎片离子，同样可在右侧窗口设定限定条件，点击“Apply Settings”左侧会自动进行离子过滤。


子离子挑选的原则：

  1. 选择3-6个fragments，越多定量越精确，尤其是对于非标定量；

  2. 单电荷的碎片离子优先考虑；这样的离子一般m/z都大于母离子，干扰信号较少；

  3. 优先选择信号强度较强的碎片离子（默认按照信号强度排序）；

  4. 丢失水或者氨基基团的碎片离子排除；

  5. 优先选择y离子


Labeling Process设定，默认的软件会自动识别谱图库的标记类型，如果是与谱图库中的标记类型一致，此处我们切换到As specified by Library即可，例如，示例的谱图库是非标定量，则此处识别的标记通道仅有一个即“Label Free”，我们直接点击“Next”进入到下一步即可。


如果我们谱图库是非标定量的数据，但是想要生成一个掺入重标肽的绝对定量的panel，则如上图Labeling Process切换至“Apply new Labeling”，workflow选择“Spike in”，Category Filter指定标记的类型为“Label，Isobaric Label”，然后在下方的编辑栏中将所有的标记通道添加上即可。需要注意的是，内源性通道虽然不含有标记，但是也需要添加上并指定为“Label Free”。


最后，我们可以预览创建的Panel的概况，确认无误点击“Finish”即可完成panel的创建。


基于创建好的Panel怎样导出方法，以及优化方法，见我们往期推文：https://mp.weixin.qq.com/s/hckdtn3BojXs6RvDyNEHZQ




接下来几期，我们将陆续对最新版本Spectronaut 19的新功能进行介绍，包括：

  • CombineSNE模式支持合并生成单个sne文件

  • 更丰富的命令行支持模式

  • 全新流程：




敬请关注我们DIA系列产品的更新！



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