Spectronaut 关于PTM DIA的位点定位算法和定量输出

Spectronaut最近几个版本更新的发力点之一就是对DIA翻译后修饰定量结果的可靠性和易用性进行了大量改进。

本文会介绍翻译后修饰（PTM）蛋白质组学搜库中的位点定性和定量，包括在DIA数据分析软件Spectronaut中的修饰位点定位算法，位点定量整合流程和工作流默认参数设置，以及报告输出。

相较于传统的DDA方法，DIA方法进行翻译后修饰的数据采集能够得到更加全面的信息比如碎片离子的完整同位素峰分布，生成与目标母离子峰型相似的色谱洗脱峰（XIC），而后者则有助于系统地去排除干扰碎片离子，这是传统DDA方法无法做到的。以上两个方面结合碎片离子强度及质量精度匹配进行鉴定评分，每个碎片离子将会得到特定的加权得分进一步用来计算特定位点的定位得分。

图 a

图b

图c

图d

首先该算法会将识别到的肽段-子离子进行组合，针对每一特定的组合，将该修饰肽段所有可能存在的修饰位点组合一一列举（如图a），然后针对每一候选的修饰位点，该算法会将该组合内的所有子离子与母离子进行匹配，从而评判该碎片离子是确证了该修饰位点的存在（Confirming）还是能够否定（Refuting）该修饰位点的存在（图c），随即结合特征峰、质量准确性和XIC（图b）相关性等方面的匹配，计算每个碎片离子的得分。最后，该候选修饰位点的得分等于所有确证离子的得分总和减去否认离子的得分总和（Score(cand)）。而该位点发生修饰的概率（PTM Probability）则为：所有包含该特定修饰位点的候选得分加和/全部修饰位点候选得分加和（如图d）。

参考文献：

Bekker-Jensen, D.B., Bernhardt, O.M., Hogrebe, A. et al. Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need for spectral libraries. Nat Commun 11, 787 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-14609-1

在SN15及以上版本中，软件除了会在原有的母离子及肽段水平报告相应定量值外，新增了PTM Site Report模块，以位点为单位展示和输出定量结果。

默认参数（如下图3）下位点定量结果的输出遵循以下原则：

1.Localization Probability阈值设定为0.75，最终Report中报告的位点都是满足该阈值的修饰位点；

2.针对特定磷酸化位点，单磷酸化和多磷酸化状态的定量分开报告（Multiplicity，如果不区分单磷酸化和多磷酸化，则不勾选此参数即可。考虑到很多研究表明特定位点在不同的Multiplicity下生物学功能不同，建议采用默认参数）；

3.针对特定磷酸化位点，其定量值为所有包含该修饰位点的母离子（见图4 PTM.Group列）的定量值的总和（对应的参数：PTM Consolidation: Sum）

Sequence window的划分，Flanking Region下可以指定划分窗口时以修饰位点为中心，向其前后各取几个氨基酸。

图3. PTM Workflow默认参数设置

图4 PTM Site Report示意图

注：PTM.CollapseKey即为修饰位点，其命名组成为：蛋白ID_位点在该蛋白序列上的定位_Multiplicity（该修饰位点所在的肽段若为单磷酸化肽段则标记为M1，若为双磷酸化肽段则标记为M2）