DIA数据分析，尤其是directDIA分析的痛点之一就是分析速度会比DDA的慢。那么本次更新之后有什么不同呢？
先说结论，由于无法获取到完全一致的对比数据，以下数据仅供参考。基于64核CPU平台分析，Thermo HFX 144针100分钟梯度采集的DDA数据检索耗时9小时，Exploris480 72针30分钟梯度directDIA数据检索耗时6小时。Bruker timsTOF Pro 33针 60分钟梯度DDAPASEF 数据检索耗时3小时。51针 60分钟梯度directDIAPASEF耗时8小时。如此极速是如何做到的呢？请看我们详细介绍：
MS2 Indexing
本次更新引入的MS2 Indexing方法旨在不降低灵敏度的同时能够提升分析速度。
MS2 Indexing方法早在2008年便由Ruedi Aebersold课题组在Nature Methods上发表用于crosslinking数据分析（Identification of cross-linked peptides from large sequence databases. Rinner et al. Nature Methods 2008）。2017年，Alexey I Nesvizhskii课题组也将其用在了DDA的数据分析上(MSFragger: ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Kong et al. Nature Methods 2017)。相比于传统的采用理论酶切产生理论二级谱峰依次匹配每个母离子的方法（下图a），MS2 Indexing极大的提高了数据处理的速度（下图b，c，d）。而在directDIA数据分析中，我们的一个痛点便是其相对DDA数据检索慢的太多。
Biognosys之所以没有在其Pulsar搜索引擎中加入MS Indexing功能在于DIA的MS2谱图相对于DDA来说复杂太多，因此分析难度和灵敏度都难以令人满意，不过在最新到来的Spectronaut16中，MS2 Indexing功能终于实装，无须升级CPU，GPU，即能大大提升分析DDA/DIA数据的效率。让我们先来看下官方数据。
DDA及PTM检索
传统的搜库软件往往添加多个可变修饰后因为搜索空间的倍数级增加而变慢非常多，同时也会影响FDR评估的准确性，如下图，在设置氧化M+磷酸化STY三个位点修饰并设置每条肽段5个最大修饰数量后，搜库空间相对于只设置单一M氧化增加了近百倍。
如下图（Biognosys官方数据），新版本Spectronaut16中，开启和关闭MS2 Indexing功能。在仅设置M氧化时，主要检索（Main search 步骤）时间大约减少了近80%，对于一个2小时Hela的DDA数据，仅需不到6分钟即可检索完毕，总体减少40%时间。
而在额外增加磷酸化3个位点STY，即3个可变修饰后，开启indexing可以缩短90%的Main search时间。
directDIA及PTM检索
DDA的速度已是如此飞快，那么directDIA如何呢？
同样的样品梯度改成DIA后进行directDIA检索，可以发现新版本Spectronaut16已经将分析时间大幅降低到了23分钟左右，而开启index后进一步降低到了20分钟。好像效果也不是很明显啊。
实际数据测试
那么有小伙伴会好奇的问了，更多修饰或更大数据集的表现如何呢？由于Biognosys没有提供更多的数据，我找了一系列不同类型数据进行了实际测试。测试平台采用的是64核 AMD3990X CPU平台。
对于新一代质谱来说检测谱图数大约是什么范围呢？最新的Exploris480 120分钟梯度DDA常规设置参数大约可以采集14万张谱图，DIA采集的话则约8万张MS2谱图。timsTOF Pro 120分钟梯度DDAPASEF大约可以采集30万张MS2谱图，DIAPASEF大约是14万MS2谱图
我们分别收集了来自于赛默飞和布鲁克的一系列DDA,DIA质谱数据，采用人/小鼠proteome（约20000条序列），漏切1，可变修饰组合每条肽段不超过3种进行测试对比，其余参数均为默认，得到如下结果。
| DDA | 耗时（min） | ||
| MS2谱图数 | 氧化M | 氧化M +磷酸化STY+ 脱酰胺化NQ | |
FAIMS480 120分钟 细胞 分9级 | 130W | 50 | 80 |
timsTOF 60分钟 细胞 分33级 | 600W | 200 | 260 |
HFX 100分钟 组织 分144级 | 1400W | 500 | 810 |
显而易见，加了5、6种修饰后搜库时间略有增加，但绝对属于您能接受的长度。
| directDIA | 耗时（min） | ||
| MS2谱图数 | 氧化M | 氧化M +磷酸化STY +脱酰胺化NQ | |
FAIMS480 25分钟 Hela 72次重复 | 115W | 360 | 520 |
timsTOF 60分钟 51个tissue | 400W | 480 | 750 |
directDIA的分析速度由于高度卷积的MS2谱图原因的确显著慢于同样的DDA数据，但仅为质谱采集时间的10%~20%的分析时间应该还是能够让您非常满意的。不过可能还是有人会问，比DDA数据显著增加的分析时间真的值得么？
有此疑问的老师敬请期待我们下一期评测：性能。
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