Spectronaut中定量策略

SN15及以上版本支持两种定量算法，即Quant 2.0和MaxLFQ。默认参数（Automatic）下，SN会根据提交的数据规模选择合适的定量算法，即提交的数据< 500个 run的情况下，默认采用MaxLFQ定量算法；如果大于500个run则默认采用Quant 2.0算法。

对于非标定量来说一个主要的问题是选择哪些肽段更有助于准确的确定样本间特定蛋白的丰度。最简单的方法则是将该蛋白所鉴定到的所有的肽段的定量值加和，或者是取平均。亦或是挑选信号强度排名靠前的某几条肽段加和或者取平均。

SN中Quant 2.0默认挑选Top1-3的肽段定量值（PEP.Quantity）取平均值作为蛋白的定量值（PG.Quantity），如下图1a所示：

图1a

图1b

如果用户需要查看蛋白定量的方法以及用于蛋白定量的肽段，可以在Report视图下（如图1b），选中Normal Report模板，在Columns下勾选需要导出的内容，关键的几列如图1a中所示E.LFQMethod则为当前数据所采用的定量算法；PG.Quantity列则为对应蛋白group的定量值；PEP.Quantity列则为对应蛋白在当前样本中所检测到的肽段的定量值；PEP.UsedForProteinGroupQuantity则显示当前的肽段是否用于蛋白定量值的计算。

参考文献：

Weisser H. Nahnsen S. Grossmann J. Nilse L. Quandt A. Brauer H. Sturm M. Kenar E. Kohlbacher O. Aebersold R. Malmstrom L. An automated pipeline for high-throughput label-free quantitative proteomics. J. Proteome Res. 2013

MaxLFQ算法认为样本间每条肽的比值都会对其所属的蛋白的丰度差异产生影响，因此都应考虑在内（类似SILAC）而不是简单的将所有肽段加和之后再进行样本间的对比。因此，MaxLFQ定量算法则是基于样本间每条肽的ratio值进行计算。

如下图以P63208这个蛋白为例，紫色覆盖的区域即为检测到的肽段（图2A），肽段对应的母离子（P1-P7，见图2B）在各个样本（A-F）中的鉴定情况如图2C。计算的第一步任意两个样本之间两两对比，得到每条肽段的ratio值，该步骤仅使用两个样本中共有的肽段（以样本B和C为例，P2、P3及P6为B、C共有肽段），那么在B、C样本的对比中，我们将会得到三个肽段的ratio值，为了避免离群值的产生，我们取三个肽段ration值的中位数作为蛋白的ratio值简写为r_BC。以此类推我们可以得到任意两个样本对比的蛋白ratio值组成一个数据矩阵（见图2C）。另外，如果一个样本与其他样本之间无法得到一个有效的ratio值，则该样本的定量值则为0，如图C中的样本F。通过最小二乘法解析得到的超定方程（图2E），即可得到每个样本中该蛋白的定量值（IA，IB，...，IF），如图2F。（PS：不要问我方程怎么解，可参考文献公式，吾的数学早就还给老师了o(╥﹏╥)o）

上图1a中对应的蛋白如果切换成MaxLFQ算法计算定量值，定量结果也会随之发生变化，结果见图3。

参考文献：

Cox J, Hein M Y, Luber C A, et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ[J]. Molecular & cellular proteomics, 2014, 13(9): 2513-2526.

图2 MaxLFQ定量算法示意图

图3. SN导出的经MaxLFQ算法计算出的定量结果示例图