(
关于文章

今天分享这篇文章，来自复旦大学刘晓慧、厦门大学翔安创新实验室熊悦婷和广西医科大学附属肿瘤医院舒宏在VIEW期刊（IF 9.7）发表的最新研究成果“The characterization of serum proteomics and metabolomics across the cancer trajectory in chronic hepatitis B-related liver diseases”。该文章基于质谱蛋白组和代谢组发现肝癌发展轨迹中的风险标志物，是刘晓慧和熊悦婷2022年合作发表在EMBO Molecular Medicine颅内动脉瘤标志物研究的姊妹篇。这篇文章在蛋白标志物的基础上进一步整合了代谢标志物的验证，与单一组学标志物组合或 AFP 等经典肿瘤生物标志物相比，诊断效果更加全面、准确、特异和灵敏。

总体标志物筛查策略延续采用四步法：

1. 建立疾病特异性的蛋白血清轮廓谱（探索阶段）；

2. 整合实验和文献中多组学数据，构建一个全面的蛋白/代谢候选标志物库；

3. 大规模全局高效筛选，候选蛋白和代谢分子靶向验证（验证阶段）；

4. 机器学习联合蛋白代谢筛查精准诊断标志物panel。

其中易算在该研究中提供的支持，包括：

本文章中使用的蛋白质组样本前处理试剂盒，DIA搜库软件（Spectronaut），质控平台EasyDIA，生信悟空云平台，以及DeepPRM预测工具均由易算提供支持和服务。

接下来我们具体看下实验方案与研究思路。


主要内容

主题：整合蛋白组+代谢组提高疾病阶段性诊断价值

蛋白组：DIA+PRM+机器学习挖掘质谱血清标志物

代谢组：非靶+靶向+机器学习挖掘质谱血清标志物

刊物：View, 2024, Accepted（IF 9.7）

1. 建立疾病特异性的蛋白血清轮廓谱（探索阶段）

首先，收集样本和蛋白代谢实验设计。文章收集了从感染HBV/HCV到发展为HCC的各个阶段血清样本，共5组，316份样本，分为3个队列：
HBV:乙肝；HCV:丙肝；LC:肝硬化；HCC:肝细胞癌(A/B/C三期)；NC:正常对照

  • 发现队列（Ⅰ）35例：用于DIA非靶蛋白组检测；

  • 验证队列（Ⅱ）246例：用于PRM靶向蛋白组和MRM靶向代谢组检测；

  • 独立验证队列（Ⅲ）35例：用于PRM靶向蛋白组和MRM靶向代谢组检测。

接下来，DIA蛋白组方案：
对于蛋白组研究，首先要制备样本，该研究要对3个队列共316份样本进行蛋白提取和酶解，可想而知是个很大的工程，这里采用易算生物快速前处理试剂盒，简化了步骤，节省了时间，3步法操作，反应时间仅需2-3小时即可获得洁净肽段用于质谱上机。
对于DIA蛋白组数据分析，采用Spectronaut软件搜库和易算搭建的EasyDIA平台质控以及悟空云平台生信分析的一整套方案，全面提升数据深度、保障大规模结果可性度并可视化蛋白统计与注释。
具体来看，文章通过6例混合血清样本来监测仪器变化，如下图所示，计算了QC样本的皮尔森相关性、肽强度分布和变异系数（CV）以及分析了所有DIA样本的蛋白强度分布。这些内容都可以在EasyDIA平台中实现，来评估数据质量。

结果显示，6例QC样本之间的相关性几乎均在0.95以上，肽强度和蛋白强度分布都均一性良好，中位数CV=0.17，说明仪器系统稳定，数据质量良好。


2. 构建一个全面的蛋白代谢候选标志物库
将每组与对照组进行比较，结果显示，DIA蛋白组共筛选到 199 种蛋白质发生显著变化。
如何建立全面的候选生物标志物库？实验 + 文献，蛋白 + 代谢
纳入DIA蛋白组筛选到的199种五个阶段血清差异蛋白，以及文献调研的肝病每个阶段的候选生物标志物——不同生物标本中与 HCC 相关的 2916 种蛋白质和 103 种代谢物。最终获得3059种蛋白和103种代谢物，需要进一步大规模靶向验证。



3. 大规模全局高效筛选，候选分子靶向验证（验证阶段）

为了完成规模化的3059个靶标蛋白质的验证和确认，需要一个工具：能增加靶向蛋白质组学的覆盖率、节约成本。

2020年，复旦大学乔亮教授、杨芃原教授课题组刘晓慧老师与易算生物在Nature Communications上发表了提升DIA数据分析的算法-DeepDIA。详见【Nat Comm-易算与复旦携手发表DIA深度学习算法】。这个工作，使用深度神经网络的原理，帮你用可检测性分数的阈值来筛选肽段。

我们进一步将该方法拓展应用为DeepPRM，使用深度神经网络的原理，帮助预测肽段的可检测性和保留时间，大大提高了PRM的验证效率。

该项目输入3059个蛋白，预测到了4217个候选肽，然后在血清酶解混合物中初步筛选到404个蛋白1038个肽，最后经人工检查后确定了404个高置信度蛋白/肽，用PRM靶向定量验证。
另外103种代谢物的大规模验证。基于DIA和PRM检测到的差异蛋白功能/通路的富集结果，来指导代谢物分析，最终选择胆汁酸及其相关氨基酸共7种代谢物进行靶向定量验证。
4. 机器学习联合蛋白代谢筛查精准诊断标志物panel
标志物筛查目的：区分(i) HCC vs 其他组（LC、HBV和NC合并为对照Ⅰ）；(ii)LC vs 其他组（HCV、HBV和NC合并作为对照Ⅱ）。

通过优化的机器学习策略最终筛选到两种蛋白质组合 （P13 和 P10）、两种代谢物组合 （M4 和 M3） 和两种蛋白质-代谢物组合 （Com-8 和 Com-12）。

引人注目地是，与 AFP等经典肿瘤标志物相比，该研究筛选到的标志物组合都表现出卓越的准确性、AUC、敏感性和特异性。在区分 LC 与HBV时，整合的蛋白质-代谢物组合 Com-12，比单一蛋白P10/单一代谢M3性能更好，能够密切监测和评估肝病进展。

标志物组合中血清蛋白变化与肝病生理病理学和致癌轨迹非常吻合：如参与血小板脱粒 （C1QC、SERPING1、TIMP1、FGG、VWF 和 EFEMP1）、细胞外基质 （ECM） （EFEMP1）、炎症 （TIMP1） 和血管生成 （VWF） 途径的蛋白质随着肝病的严重程度而逐渐增加，RBP4 和 BTD 的水平从正常到肝病进展持续下降。三种候选代谢物（胆碱、甜菜碱和牛磺酸）先前也与 HCC 有关。
基于机器学习对大规模定量数据进行高性能标志物组合筛选和评价的完整思路，我们也可以实现：采用多种算法，如支持向量机(SVM)、随机森林、逻辑回归、神经网络以及其他算法模型的比较等，结合ROC曲线和混淆矩阵进行模型性能评估，确立打分最佳的biomarker组合。
总结

到这里，对该文章实验和分析思路解读结束。我们再回头看看筛查验证疾病风险因子这件事，关键在于两点：1）发现阶段，基于LC-MS构建大队列的高效、深度、全面的候选标志物库，2）验证阶段，大规模快速靶向定量检测，机器学习获得准确、特异和灵敏的标志物组合。

基于此，我们搭建了完整的血液蛋白组解决方案：

①采用快速低丰度富集试剂盒+自动化的高通量方案进行样本制备，96例样本仅需3-4小时即可直接从血浆/血清到洁净肽段上机，更关键的是血液低丰度蛋白增加3-10倍。

② 高性能质谱DIA谱图配合Spectronaut专业解析软件，可最大限度地发掘深度信息，包括EasyDIA等质控和生信分析平台，可快速有效地收获可信结果与可视化图表。

③ 从发现到验证，根据不同临床大队列分组设计和研究目的，我们有不同的场景方案，快速助力从大批数据中逐渐聚焦关键分子与功能。



参考文献

 https://doi.org/10.1002/VIW.20240031

 

易算支持 

本文章中使用的蛋白质组样本前处理试剂盒，DIA搜库软件（Spectronaut），质控平台EasyDIA，生信悟空云平台，以及DeepPRM预测工具均由易算提供支持和服务。

 

关于血液蛋白质组样品，从预处理到数据分析，易算有一套完整、快速且深度的解决方案。如果你也有相关课题，想针对血浆/血清样本寻找蛋白标志物，欢迎联系我们。


    
继续学


EasyPept-DeeP低丰度富集前处理试剂盒
蛋白质组自动化进行到底，易肽Auto150焕新升级
EasyPept DeeP低丰度蛋白富集联用AUTO100自动化效果
DeePB血液深度蛋白质组检测和分析方案
EMBO Mol Med复旦-易算最新临床蛋白质组成果 | 准确率90% |利用蛋白分子标志物 + 机器学习对患者风险分层

直播回放|PRM案例实操-DeepPRM与SpectroDive强强联合


关于我们