关于磷酸化蛋白质组定量研究，我们想说的(一)
写在前面的话：上一次笔者介绍了糖基化蛋白质组学研究的一些发展概况，这一次想就磷酸化蛋白质组定量研究谈谈自己的一些粗浅的想法，也欢迎蛋白质组学界的各位同行们留言就此话题展开讨论。
与糖基化蛋白质组学研究不同的是，磷酸化蛋白质组从蛋白质组学发展初期就引起了广大研究者们的重点关注和深入研究。从初期到现在，不论是实验技术、分析方法，还是试剂研发、仪器开发等方面，都已有了长足的发展和进步。可以这么说，磷酸化蛋白质组学研究的整套流程已经非常成熟，我们更需要关注大规模样本的自动化样品处理技术、实验方法的标准化流程建立、定量数据的重复性与可靠性，以及被挖掘到的磷酸化位点的生物学意义上。
我们还是先简单介绍一下蛋白质磷酸化修饰吧：磷酸化修饰是指在激酶的催化下，将ATP的磷酸基团转移到底物蛋白的丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸残基的过程；磷酸化修饰是发生最为广泛的共价修饰和最重要的调控修饰，与信号传导、细胞周期、生长发育、癌症的发生发展等密切相关；该过程可逆，磷酸化和去磷酸化分别由激酶和磷酸酶催化，在某一给定时刻，真核细胞中至少1/3以上的蛋白质正在发生磷酸化修饰；其主要的磷酸化类型——Ser (S) : Thr (T) : Tyr (Y)≈1800 : 200 : 1。基于质谱技术的磷酸化蛋白质组学研究路线说起来很简单（如图1所示）：从研究对象中提取蛋白，酶解成肽段，采用合适的富集技术将磷酸化肽段特异性的挑选出来，进行LC-MS/MS分析，拿到串级谱图，进行后续的鉴定和定量分析。然而，磷酸化蛋白质组学研究具有极高的技术挑战性，这是因为：1）磷酸化过程瞬时发生且可逆，对样品采集和储存的要求都非常高；2）磷酸化蛋白质的固有含量非常低，样品处理时所采用高效的特异性富集手段非常必要；3）由于磷酸基团所引入的负电荷，使得修饰肽段更加难以离子化；4）磷酸化修饰和硫酸化修饰所产生的质量偏移非常接近（phosphorylation 79.96633; sulphation 79.95682），容易造成假阳性结果的产生。
谈到特异性富集策略，目前常用的有以下几大类：免疫亲和色谱富集法（采用专一识别磷酸化氨基酸残基的高特异性抗体）、固相金属亲和色谱法（IMAC）、金属氧化物亲和色谱法（TiO2/Al2O3/ZrO2/…）、色谱预分离法（强阳离子交换色谱SCX、亲水性相互作用色谱HILIC）、化学衍生修饰法（beta消除法+生物素标记、碳二亚胺缩合法等）。选择什么样的富集策略，完全取决于你的研究目的是什么：是大规模磷酸化位点的鉴定，还是靶向性磷酸化蛋白的分析。因为很难有一种十全十美的富集方法，在保证高灵敏度的同时达到特别好的选择性。目前，两大类最为常用的磷酸化富集技术，应该算是二氧化钛亲和色谱法（TiO2）和固相金属亲和色谱法（IMAC）。TiO2亲和色谱法特异性富集磷酸化肽的原理是磷酸肽上的磷酸根通过桥式双齿配位的形式结合于TiO2表面（如图2所示）。而IMAC的原理则是通过固定相上的螯合剂与金属离子形成配位化合物而将金属离子固定于其上，利用磷酸基团上的负电荷与IMAC柱上金属离子的正电荷之间的静电相互作用而选择性的对磷酸化肽进行吸附。
在磷酸化肽富集研究这方面，个人认为必须提到的是大连化物所邹汉法教授课题组发展的基于自主研发的新一代Ti4+-IMAC材料发展的高特异性富集策略。该项技术能够满足高通量、高重复性的大规模样本磷酸化蛋白质组研究的需求，相关研究工作发表于国际权威杂志Nature Protocol上（见图3，Zou HF et. al, Nature Protocol, 2013 8 (3): 461-480.），并已于2018年实现了商品化，目前已经可以从百灵威处购买使用。
一旦我们确立好实验项目所要选取的富集方法，那么接下来应该考虑的则是采用哪种定量方法。在不考虑技术创新性的前提下，仅从实验设计本身出发，目前在后修饰蛋白质组学定量研究中应用最为广泛的两类定量方法为：非标记定量（label free quantification, LFQ）和基于等重同位素标签的化学标记定量（iTRAQ & TMT）。简单来说，磷酸化蛋白质组定量研究的整个实验流程大致可以分为蛋白提取、酶解/酶解标记、磷酸化肽富集、LC-MSMS分析、数据分析、统计分析、生物信息学分析等步骤（图4）。
在今天的话题中，我们仅简单阐述下基于一级谱图的非标记定量技术和使用二级谱图的传统iTRAQ和TMT技术各自用于磷酸化蛋白质组学的优劣势，算作是这个专题的开门篇吧（图5）。
如果采用非标记定量技术，优势很明显，因为非标定量对于样品的需求量低，也不需要额外增加样品处理步骤，操作简便、样品损失小，相较而言，单次实验可定量到的蛋白数目更多。然而，其劣势也不言而喻，因为非标定量的依据是一级谱图的峰强度或者峰面积，所以定量数据的数据质量很重要，且严重依赖于质谱仪器的稳定性。相较于iTRAQ和TMT方法，非标定量在后续数据的处理上会更为复杂一些。如果是比较珍贵的样品，或者说实验预算相对较为有限，我们更为推荐进行磷酸化蛋白质组非标记定量实验。如果有这方面需求的同行，可以参考Matthias Mann发表于2018年Science上的一篇关于磷酸化蛋白质组学在信号通路研究中的研究文章（Liu et al., Science 360, 1314 (2018)），其中采用的技术路线就是通过二氧化钛富集后进行非标记定量来寻找显著差异表达的磷酸化位点（图6）。
如果采用基于等重同位素标签的化学标记定量方法（iTRAQ/TMT）来进行磷酸化蛋白质组定量研究，相对于非标记定量，这种定量方法虽然样品量需求相对较大，试剂费用偏高，由于多出来的标记步骤而引入了一定程度的样品损失，然而，其优势在于定量准确度更高，不同标记通道的合并检测不仅可以有效地减少仪器系统误差，还能减少缺失值的发生概率，对于翻译后修饰定量蛋白质组学这类更侧重于具体位点上修饰变化的研究领域来讲，更适用于建立不同区域不同实验室之间的标准化流程，以期与基因组数据更好的相关联。在2018年的Nature Protocols上（图7，Mertins P., Nature Protocols, 13, 1632–1661.），发表了一篇详细阐述采用TMT-10plex定量标记方法同时进行全蛋白质组和磷酸化蛋白质组学分析的实验流程。该文章的结果显示，来自于三个不同实验室的研究人员，采用同一套标准化实验流程，在对于两种不同乳腺癌亚型PDX模型的全蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行定量研究时的数据表明该方法具有相当可行的被转移性，其所获得的整体定量数据可重复性非常好（不同的生物学重复/不同的实验室之间所得到的最大偏差＜7%），不同实验室之间所得到的磷酸化蛋白质覆盖率的最大偏差小于24%。整个流程，对100个样品进行从样品前处理到数据的采集分析，一台LC-MS/MS仪器可在大约4个月的时间内完成。
笔者按：从上面列举的两篇高质量文章可以看出，选择何种富集策略，采用哪种定量方法，完全视研究课题的具体情况而定。这年代的技术发展速率如此之快，研究人员所要做的，就是保持一颗热情而不失好奇的心，勇于尝试，严谨实验。我们期待在大数据时代，不论是仪器硬件、实验手段，还是数据分析、算法开发上，都能够不断涌现出新的进步和发展，从而推动蛋白质组学研究的不断前行，为人类能够终极攻克各类癌症贡献出力量。
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