文章名称：Best practices for single-cell analysis across modalities（IF=41+）
文章链接：Nat Rev Genet (2023). https://doi.org/10.1038/s41576-023-00586-w
文章参考理由：文章总结了单细胞分析的最佳实践，包括单模态和多模态的数据处理和集成方法。单模态是指只测量单细胞的一种分子特征，比如转录组、表观遗传组或蛋白质组。多模态是指同时测量单细胞的多种分子特征，可以提供更全面的单细胞信息，揭示不同分子层面之间的关联和差异。
重点章节：Single-cell data resolved in space
单细胞技术的快速发展，使跨类型的数据以及包含位置信息的细胞高通量分子分析成为可能。单细胞组学数据，尤其是转录组现在可以通过染色质可及性、表面蛋白表达、适应性免疫受体库分析和空间信息进行补充。随着跨模态的单细胞数据的增加，新的计算方法也被加速开发，以促进分析师获得生物学见解。比如下图：
Fig. 1: Single-cell analysis across modalities
你可以看到，代表了单细胞分子模态的多样性和关联性。不同的分子模态可以提供不同的细胞信息，比如空间位置可以反映细胞在组织中的分布和相互作用，免疫受体可以反映细胞的免疫功能和多样性，表面蛋白可以反映细胞的表型和信号传导，转录组可以反映细胞的基因表达和状态。这些分子模态之间也存在着关联和影响，比如转录组可以影响染色质可及性和表面蛋白的表达，空间位置可以影响转录组和免疫受体的变化等。因此，单细胞分子模态的多样性和关联性为我们理解细胞的复杂性和异质性提供了丰富的信息。
篇幅原因， 让我们把目标聚焦在空间单细胞。
在多细胞生物体中，细胞互作形成空间结构的微环境，这些微环境在不同样本和条件下会有所不同。
空间技术主要分两种，一个是基于阵列（比如下面的图6a）,一个是基于图像（比如下面的图6b）. 基于阵列和基于图像的空间组学，都需要工具把测得的分子分配给单细胞。
Fig. 6: Overview of spatial transcriptomics preprocessing and downstream analysis steps（空间转录组的数据预处理与下游分析流程展示; a\b为获得细胞的统计矩阵和空间坐标；c为识别细胞的边界和位置；d为通过不同的方法来分析细胞之间的相互作用和信号传导的机制 ）
获得细胞的统计矩阵和空间坐标
先说基于阵列(图6a)。由于基于阵列的检测没有捕捉到单细胞的分辨率，在空间转录组数据中，每个点（spot）代表的是一个小区域内的多个细胞的转录组的平均值，而不是单个细胞的转录组。因此，每个点的基因表达谱反映的是这个区域内的细胞类型的组成比例，而不是某一个特定的细胞类型。例如，如果一个点包含了50%的上皮细胞和50%的免疫细胞，那么它的基因表达谱就是这两种细胞类型的基因表达谱的平均值，而不是上皮细胞或免疫细胞的基因表达谱。这就需要我们在分析空间转录组数据时，考虑到点与点之间的空间关系和细胞类型的混合情况，而不是直接将每个点当作一个单独的细胞来处理。
有很多方法可以用来将基于阵列的基因表达谱，分解为不同的细胞类型的比例。文章提到了三种方法-Cell2location、SpatialDWLS和RCTD往往是根据一个单细胞分辨率的参考数据集，来估计每个点内的细胞类型的组成比例。单细胞分辨率的参考数据集是指一个包含了不同细胞类型的基因表达谱的数据集，可以用来作为一个标准来比较和匹配空间转录组数据中的点。这些方法是通过计算每个点的基因表达谱与参考数据集中的不同细胞类型的基因表达谱之间的相似度或相关性，来推断每个点内包含了哪些细胞类型，以及它们各自占的比例。
紧接着要讲基于图像（图6b）。对于基于图像的检测，如荧光原位杂交（FISH）和原位测序（ISS），细胞计数矩阵（cell count matrices）和空间坐标（spatial coordinates）是通过细胞分割获得的，结果往往需要有微调以获得有价值的分割效果。
怎么提高分割效果？一些工具如Giotto和squidpy，允许在分析管道中加入定制的分割方法，这简化了对所选方法的比较、选择和评估。此外，转录本的定位可用于无分割方法，如SSAM或Baysor，它们直接将细胞标签分配给空间上的近似像素。Baysor还结合了通过组织学图像获得的细胞形状信息来加强分割结果。这些工具对于基于分割的方法很有用。
通过基于阵列的空间转录组学和细胞类型去卷积获得的基因表达矩阵，或通过基于图像的空间转录组学和分割获得的基因表达矩阵，可以用与scRNA-seq数据类似的方式进行过滤、规一化和可视化。
细胞特性和细胞微环境的表征
紧接着要讲图6c。在空间转录组数据中，可以通过不同的方法来识别细胞的结构，即细胞在组织中的位置和形状。
有些方法可以达到单细胞的分辨率，即可以区分每个细胞的边界和位置；有些方法只能达到BC（barcode）区域的分辨率，即只能区分每个点或像素的位置，而不是每个细胞的位置。在基于图像的空间转录组数据中，由于只测量了一部分预先设定的基因（而不是所有的基因），所以不能得到完整的细胞转录组信息。这个问题可以通过空间映射来解决，即利用一个单细胞分辨率的参考数据集，来推断空间转录组数据中没有测量到的基因的表达水平，并将它们赋予相应的空间坐标，这样就可以得到一个包含了所有基因和空间信息的单细胞分辨率的空间转录组数据。
Tangram就是一个这样的方法，它通过优化空间转录组数据和单细胞RNA测序数据之间的基因相似度来填补未检测到的基因。它被证明在准确度和可扩展性方面优于其他的填补方法，比如gimVI和SpaGE。
除了根据细胞的基因表达谱来给细胞打标签之外，还可以利用细胞在空间上的位置来识别细胞的类型。有些工具，比如BayesSpace、stLearn和spaGCN，可以通过考虑基因表达谱和空间邻域结构两方面的信息来识别所谓的空间域。空间域是指在组织中有相似基因表达谱和相近位置的一片区域，它可能反映了数据集的整体形态。通过给空间域打标签，就可以识别出组织中不同的区域和类型。
不同样品的细胞微环境的识别可能会受到图像方向的影响。在整个数据集中，图像可能并不总是完全对齐的，在不同的视野中比较研究结果可能是一个挑战。Tangram、GridNet和eggplant产生了跨样品的共同坐标框架，以缓解这一问题.
分析细胞之间的相互作用和信号传导的机制
紧接着要讲图6d。在空间转录组数据中，可以通过不同的方法来分析细胞之间的相互作用和信号传导的机制，这些方法都是基于细胞在空间上的位置信息。具体来说，可以通过以下几种方法来进行分析：
识别在空间上变化的基因，即那些在不同的位置或区域有不同的表达水平的基因，这些基因可能反映了细胞在空间上的分化或功能差异;
分析细胞的邻域，即那些在空间上相邻或接近的细胞，这些细胞可能有相似的类型或状态，或者有更强的相互作用或影响。
推断细胞之间的通讯事件，即那些基于受体和配体、紧密连接、机械效应或间接机制的信号传导过程，这些过程可能影响了细胞的行为或命运。
在组织中，细胞之间有直接的接触，可以通过细胞表面的分子、远距离的分泌物、生物力学的作用或者间接的方式（比如代谢物）来互相影响。这些影响会导致细胞的基因表达发生变化。
细胞之间的互相影响可以从分离的单细胞RNA测序数据中找出来，就像上面说的那样。但是，这些方法往往忽略了组织本身的空间结构，这可能会导致一些错误的发现。
分析空间上的细胞互相影响的方法通常是根据周围邻近细胞的基因表达模式来比较。GCNG、Misty和NCEM把这个任务看作是用图神经网络来处理由细胞构成的空间图，SpaOTsc用最优传输来处理，而SVCA用空间方差分量分析来量化细胞互相影响对基因表达的影响。
总结
如何整合空间和其他模态的数据，即把细胞在组织中的位置信息和细胞的其他分子信息（如基因、蛋白质等）放在一起，以便更好地理解细胞的特征和功能？
常规：有很多方法可以实现这种整合，比如：使用聚类，把空间数据和其他模态的数据映射到一个共同的潜在空间中，发现跨模式的细胞亚群。
文章：提到了使用空间映射（spatial mapping），把没有空间信息的单细胞RNA测序数据和有空间信息的目标基因数据对齐起来，填补空间数据中没有测量到的基因的表达水平；使用图神经网络（graph neural network）或其他方法，把空间数据和其他模态的数据表示为由细胞构成的空间图，分析细胞之间的相似度或相互作用。
除了今天解读的内容，文章还包括数据预处理、质量控制、降维、聚类、差异表达、轨迹推断、批次校正、数据集成和可视化等步骤（点击文末阅读原文跳到该文章提到的在线书籍）有 50 多个章节，包括详细的代码示例、分析样例以及对计算需求的评估。
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