前言

血液流经全身，除了其本身与血液功能相关的物质外，还接纳了全身各处器官释放的物质，反映了机体整体的生理状态，再加上其临床易获取性，血液已经成为临床检测不可或缺的生物样本，临床生物标志物的发现也往往基于血液样品的筛查。近来飞速发展的液相-质谱串联技术，也将基于蛋白组学的临床血浆生物标志物筛查推上了舞台，科研界、临床界、生物制药领域纷纷把目光聚焦于此，其背后既充满希望，也极具挑战。蛋白质组学能否为临床诊断、预后以及疗效评估提供更快捷、更经济、更可靠、更灵敏、更特异的血浆生物标志物筛查策略呢？



首先需要指出的是，目前临床上基于血液蛋白的生物标志物检测，主要基于酶联免疫反应，基于质谱的蛋白生物标志物检测还未在临床应用。但酶联免疫反应需要高质量抗体，操作过程繁琐，无法轻松应对大样本、多标志物的检测。目前基于血浆蛋白质组的生物标志物研究，仅占所有蛋白质组研究的不到1%，且研究数量在逐步下降，说明该研究的困难性，但也表明发展该研究的重要性。另外，在所有基于血浆蛋白质组的生物标志物研究中，只有不到一半的研究进行了后期验证，其中有半数采用Western blot， ELISA技术，且仅在原有的样本上进行重复验证，只有23%的研究在新的样本中进行了验证，而其中只有36例研究采用了质谱技术进行后期验证。
令人遗憾的是，由于质谱机时的关系，在选择的样本量上，目前大部分研究仅采用几十例血样，少数会达到百例，其中如果还涉及疾病的不同时期，那每个时期的样本数就更少。血液样本本身个体差异非常大，基于少量样本得到的生物标志物，其可信度就令人担忧，无法说清是真实的反应了疾病的状态，还是由于个体差异，或者实验引入的人为误差导致。因此，研究者提出应该像GWAS研究那样，纳入足够多的样本，足够多的样本才能消除个体差异带来的影响，提高显著性，哪怕蛋白表达差异不足以达到常规的1.5或者2倍，也能认为是有生理意义的变化。
作为临床标志物筛选，血液样本究竟该不该除高丰度，也是争论的问题。尽管除高丰度可以提高质谱检测的深度，但除高丰度蛋白的同时，会一并带走那些与高丰度蛋白相互结合或者相互作用的蛋白，无法代表真实的生理状态，同时过多的操作步骤也会引入额外的差异。因此，不除高丰度是最理想的选择。然而，不除高丰度的情况下，目前的质谱技术仅能达到300左右血浆蛋白的检测率，其中大部分是跟血液相关的蛋白，这些蛋白能否真是代表疾病状态，还有待研究。如果要覆盖与病理过程直接相关的器官组织外泄的的蛋白，那蛋白鉴定率必须达到1500个以上，这是目前质谱技术还无法达到的。目前所发现的23%的生物标志物主要集中在这300个高丰度蛋白中。因此，不除高丰度是血液临床生物标志物筛选的首选，但如果需要筛选更多与疾病直接相关，而非血液活动相关的的蛋白，则需要发展更好的质谱技术，但相信这是未来可以实现的。
另外，还有些研究会将血液样品混合，这降低了个体差异，但也可能造成某些偏差大的个体影响了整组样本，最终得到的差异蛋白无法真实体现人群的病理特征。
目前的生物标志物筛选流程依从“三角策略”，即：发现阶段用较少的样本，先用质谱筛选出一批可能的差异蛋白，中间阶段扩大样本，用靶向质谱验证差异蛋白，最后阶段再次扩大样本，用酶联免疫检测最终确认差异蛋白是否为生物标志物。但目前来看，做到所有以上步骤的研究非常少，大部分只包含第一步，或者在第一步的基础上，利用原样本进行酶联免疫检测。无法完整的完成所有过程的原因，一部分是因为其中涉及三种技术，复杂而繁琐。

因此，Matthias Mann提出“矩形策略”。在该策略中，发现和验证阶段均基于大规模样本，但都利用同样的shotgun技术。这样做，两部分样本可以同时进行检测，不需要做完第一波样本，得到差异蛋白后再进行第二波样品的验证。两部分样品共同鉴定到的差异蛋白可以认为是可能的生物标志物。因为人体基因组编码了约20000个蛋白，但却与14500种疾病相关，因此不可能一种蛋白反应一种疾病。好的生物标志物应该是一组蛋白，蛋白组合可以提高生物标志物的特异性和灵敏度。这种矩形策略就可以提供多种可能的差异蛋白信息。

总结来说，作为临床标志物筛查技术，必须满足快速、简便、可靠的特性。因此，对于基于质谱的血液蛋白标志物筛选，对样品制备、样品检测以及样品分析提出来非常高的要求，如何简化样品制备流程，提高质谱检测灵敏度，加快数据分析流程，最终得到可靠的生物标志物，是目前需要解决的问题。另外，如何将发现的生物标志物与其他临床症状和检测数据结合，快速给医生提供明确的决策信息，还需要依赖如今的大数据和深度学习，开发合适的算法。但总得来说，基于血浆蛋白质组发现临床生物标志物是非常令人期待的，它会使划时代的突破，给临床诊断、预后、评估带来革命性的变化。


参考文献

Philipp E Geyer1, Lesca M Holdt, Daniel Teupser, Matthias Mann. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics[J]. Molecular Systems Biology,2017, 13: 942-957.



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