如何做:好的蛋白质组学？ 202012update | OmicSolution 公众号资料馆

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12月初在西湖大学举办的临床蛋白质组学研讨会和培训班让大家享受了一场蛋白质组学从样品制备到数据分析前沿进展和应用的盛宴。

易算生物也有幸在其中为大家介绍了最新的如何获取高质量蛋白质组学结果的方案。

我们坚信：解决掉木桶效应中最短的那块板，就可以得到最理想的结果。我们也坚信：中国每个做蛋白质组的实验室都能在我们的协助下大幅提升蛋白质组的结果质量。

下面我们给出我们近期探索对比的结果，并展示数据对比，您可以参考相应结果对比自己的方法。如需我们协助提高数据产出质量，欢迎和我们联系。

方法

原始样品处理：该步骤因样品不同差异极大，我们将在后续陆续推出解决方案；

蛋白制备：得到蛋白后，直接使用PreOmics iST 试剂盒，适用范围：1-100ug蛋白，标记和非标记实验，各类样本均可处理，从蛋白到多肽上机，只需2小时。

设备：PreON全自动样品制备工作站（可选），iST 蛋白制备试剂盒，离心机、可加热到90度摇床，移液枪，37度恒温摇床，ep管。

优点：超快速，2小时内从蛋白到多肽；超低漏切率，漏切小于5%，无非特异性修饰；鉴定结果优于常规方法（见下文测试）

缺点：价格比全手工处理贵。

多肽分离：液相色谱：基于Thermo解决方案的主流液相是nLC 1200，该设备缺点是灵活性较差，无法支持超长梯度，上样时间较长，优点是易用稳定，我们的方案暂时不涉及昂贵设备的替换，故继续使用该设备。

色谱柱：采用IonOpticks 25cm 1.6μm填料一体化色谱柱，适用30min~180min各类梯度，流速控制400μL/min，柱压约400-500bar，本色谱柱最大耐受柱压超过1000bar。

柱温箱：采用eOmics 20-70度控温柱温箱，控温精度0.1度；

优点：高柱效，全峰宽约15秒，有效使用时间大于2个月，即插即用，0死体积；

缺点：价格比手工填装柱子贵

质谱方法：本文以Thermo Orbitrap Fusion/Lumos/Exploris 480系列质谱为测试平台，后续会陆续推出其他质谱的数据展示。

基于Orbitrap质谱平台我们强烈推荐基于DIA的定性/定量路线，方法主要参考Thermo 官方的HRMS1 定量策略，该方法目前经过我们测试，能够实现定性、定量两种需求的最佳平衡，是做蛋白定性、组学定量的最佳利器

优点：DirectDIA联用Orbitrap系列仪器目前方法成熟，结果历经考验，适用小规模到大规模，修饰非修饰等各类实验路线；

缺点：DIA暂时还不擅长分析内源多肽（De Novo路线）、N糖基化位点定性定量（DeltaMass过小，谱图混合）

数据分析：Spectronaut当仁不让，仅需二十多分钟即可完成一个样品DirectDIA全部分析（建库DIA仅需2-5分钟/样品）。

优点：目前最权威，最可靠，最易用的DIA数据分析软件

缺点：暂时没有

结果质控：基于我们整理收集的蛋白质组学数据质量要点，易算开发了OmicsCloud平台进行专业全面的数据质控评估，目前已开发部分客户内测。您也可以登录全文链接中的页面进行demo数据分析查看。

https://project.omicsolution.com/omicscloud/dashboard/

实验步骤

我们根据多个用户的个人偏好进行了多次平行测试，以供大家参考。

备注：1.以下除特别标注外，所有DIA测试均为不建库DirectDIA方法

2.Peak Capacity反映柱效，与FWHM直接相关，相同条件下FWHM越小表明柱效越高，不同采集方式数据不可直接对比

3.测试软件均为Biognosys Spectronaut/SpectroMine系列软件，数据库均为One Protein One Gene的Uniprot最精简数据库，质控标准均为最严格 PSM/PRECURSOR 1%,PEPTIDE 1%, PROTEIN GROUP 1% FDR. 经过陷阱库（Homo Sapiens+ Arabidopsis Thalianna)测试，实际FDR符合设定FDR表现。（Hela测试数据的6500阳性PG中，拟南芥专属错误蛋白PG检出低于50个）

测试1

测试平台：Thermo Fusion（使用8年），Pierce Hela

测试目的：比较传统商品柱和IonOpticks的性能差异

测试条件：分别测试了DDA模式下不同梯度，25cm Acclaim 2.0和IonOpticks 1.6填料差异，柱温50度。