周末结束，我们继续关注质谱蛋白组应用。
今天重点介绍三篇采用纵向队列设计的研究，展示其在疾病监测和治疗反应预测的作用。

文献1：高分辨率血清蛋白质组轨迹揭示了COVID-19患者特异性血清转化

影响因子：11.1（EMBO Mol Med）

题目：High-resolution serum proteome trajectories in COVID-19 reveal patient-specific seroconversion

链接：DOI: 10.15252/emmm.202114167

方向：纵向队列的疾病监测

质谱规模：720

年份：2021

研究设计

本研究将样本分为两组：COVID-19患者组和阴性对照组。

31名COVID-19患者纵向跟踪，共采集了458份血清样本，这些样本在患者54天的疾病进程中多次采集，具体时间间隔不一。此外，研究还对262名阴性对照者进行了单时间点采样（如下图A-C）。

图1（原文编号）：纵向取样以及LC/MS系统的蛋白鉴定自动化工作流程

实验方法

在实验方面，研究者采用Evosep One系统结合Bruker timsTOF Pro质谱仪，在12天内完成了720份血清样本的检测。质谱鉴定出502种蛋白，覆盖了超过5个数量级的MS信号强度。对照组和患者组单次采样的蛋白质鉴定中位个数分别为312（±18）和308（±16）。

关键发现
纵向队列设计的优势在于能够追踪蛋白质水平的动态变化，研究中识别出三类主要的蛋白质变化趋势：
  • 类1：随住院时间逐渐减少的蛋白，主要与先天性免疫系统相关。
  • 类2：逐渐增加的蛋白，涉及脂质稳态和凝血功能。
  • 类3：免疫球蛋白类蛋白在前三周内上升后开始下降，这一现象在2021年前的研究中尚未报道。

图4：COVID-19 中差异蛋白的蛋白簇

血清蛋白质组不仅可以看队列水平的变化，在个体水平上也同样显著。

通过计算个体患者在不同时间点的血清蛋白Pearson相关系数，发现个体在连续几天内的蛋白质组相对稳定，而超过一周后变化显著（见图4D-F）。比如免疫系统相关蛋白（如CRP和SAA1）在住院过程中显著下调，而脂质稳态和凝血功能相关蛋白逐步上升。因此纵向数据可以验证COVID-19相关的凝血病理现象。研究还发现，特定蛋白（如ITIH4）的早期升高可作为疾病死亡率的预测指标，体现纵向设计在疾病预后评估潜力。

图 EV4：ITIH4的早期升高火山图

此外，在长达几十天的血液采样周期里面，除了质谱蛋白组，医生也追踪了患者的抗体从生成到峰值的全过程。文章发现即使在那些常规抗体测定未显示但是实际上有明显反应的个体中，通过这种高分辨率质谱分析也能够识别出响应病毒感染的关键蛋白质。比如在一些病例中，尽管抗体免疫测定的信号弱，质谱分析却能显示出免疫球蛋白区域的显著增加，其表达倍数与免疫测定中检测到的阳性反应患者相似。这表明质谱技术能够捕捉到更细微的免疫反应变化，这些变化可能在使用传统方法时未能被检测到。

此外，通过质谱检测，观察到了FCGBP（IgGFc结合蛋白）的水平变化，这种蛋白在先前的研究中已被发现在自身免疫疾病患者的血清中表达上调。在本研究的COVID-19患者样本中，FCGBP的变化与抗体生成过程中的不同阶段相一致，表明其可能是感染后免疫响应的重要标志物。

图6：COVID-19 血清转换期间的抗体分泌

总结

纵向队列设计在本文揭示了COVID-19患者血清蛋白质组的动态变化，特别是找到了免疫响应方面的潜在的标志物。

文献2：卧床休息的健康受试者血浆蛋白质组分析发现了与肌肉萎缩有关的分子变化


影响因子：8.9（J Cachexia Sarcopenia Muscle）

题目：Plasma proteome profiling of healthy subjects undergoing bed rest reveals unloading-dependent changes linked to muscle atrophy

链接：DOI: 10.1002/jcsm.13146

方向：疾病监测

质谱规模：40+

年份：2023


实验设计

本文借助“one-buffer sample preparation”来集成从裂解到蛋白的消化与肽段纯化和洗脱的全过程以提高样本处理的效率和一致性。对于质谱分析，使用高分辨率的Orbitrap Exploris 480质谱仪，通过应用数据独立采集（DIA）策略获得全面的蛋白覆盖和定量结果。

检测10名年轻男性---在卧床休息前（BR0）-10天卧床休息（BR10），后（R+2）这三个时间点采样，检测血浆蛋白丰度的变化。为了验证肌肉萎缩与显著变化蛋白之间的相关性，分析了7名癌症患者和年龄匹配的7名对照组的血清样本。总共鉴定到了535个蛋白，技术重复的平均 Pearson 相关性为 >0.96。

研究结果

结果显示，卧床休息影响了血浆中补体级联蛋白、脂质载体蛋白和组织渗漏源蛋白丰度。teneurin-4在卧床第10天显著上调，而恢复期第二天显著下调；lumican的含量在卧床第10天显著下降，并在恢复期维持低水平。此外，transthyretin等六种蛋白质能区分易发生肌肉萎缩的个体。癌症恶病质患者血清中haptoglobin-related protein含量显著降低。HPR同样是区分易萎缩和抗萎缩间的潜在marker。

关键蛋白表达规律、涉及到的网络

总结：研究结果强调了血浆蛋白组变化可以作为潜在生物标志物，用于预测和监测肌肉萎缩。


文献3：纵向血浆蛋白组学分析揭示CRC诊断和单抗治疗反应的生物标志物

题目：Longitudinal plasma proteome profiling reveals the diversity of biomarkers for diagnosis and cetuximab therapy response of colorectal cancer.

链接：doi: 10.1038/s41467-024-44911-1

方向：诊断；疗效反应预测

质谱检测：血浆（600+） + 组织（50+）

年份：2024

纵向的采样频率：共覆盖最多9个时间点。

CRC的进展具有时间和空间上的异质性，单次采样难以全面反映疾病的动态变化。血液的动态采样能够在多个治疗周期内连续监测患者的生物标志物变化，捕捉疾病进展和治疗反应的实时动态。

实验设计

  • 血浆发现队列

样本数量：116名CRC患者（CRCs）和66名健康对照（HCs），共收集540个血浆样本。

CRC患者：治疗前89个血浆样本；治疗后385个血浆样本（在持续多次抗EGFR治疗过程中采集）

  • 血浆验证队列
样本数量：31名CRC患者和24名健康对照，共收集101个血浆样本。
CRC患者：治疗前31个血浆样本；治疗后46个血浆样本

  • 组织验证队列

样本数量：31个肿瘤组织样本及27个配对的正常邻近组织（NATs）。均来自31名未接受治疗的CRC患者作为匹配血浆样本的独立组织验证队列。

  • 临床指标

年龄和性别在CRC患者与健康对照之间平衡，无选择偏倚；收集的临床参数（血清LDH水平、WBC计数、淋巴细胞数、血红蛋白、血小板计数）在CRC组间无显著差异；以及需要收集的其他数据包括肿瘤分化程度、ECOG评分及其他生化指标

哪些产出

分为以下三个方面，对于纵向数据来说主要体现在第三个。

1、蛋白质组数据找到用于CRC诊断的生物标志物
差异比较治疗前CRC患者与健康对照的蛋白。然后在独立的组织验证队列中验证这些诊断标志物性能。

2、鉴别用于初始治疗反应预测的生物标志物

对治疗前CRC患者的蛋白质组数据进行一致性聚类，生成不同的蛋白质组亚型（如G-I，G-II，G-III）。然后将聚类结果与治疗反应（敏感组S vs 非敏感组NS）关联，筛选与初始西妥昔单抗治疗反应相关的关键蛋白质，找到这些蛋白以后在独立的血浆验证队列和组织验证队列中验证这些预测标志物的准确性。

3、鉴别用于多疗程治疗纵向反应预测的生物标志物

  • 基于纵向采样的血浆人群，根据患者对西妥昔单抗治疗的反应模式（逐渐耐药或始终耐药/不耐药）分为两个子队列。
  • Sub-cohort 1包含22名CRC患者，其特征是在首次治疗时对西妥昔单抗敏感，随后7个疗程中逐渐出现耐药，共105个纵向血浆样本；Sub-cohort 2包含76名CRC患者，分为稳定敏感组（SSG，18名患者，38个样本）和稳定耐药组（SNSG，58名患者，153个样本）。
  • 对于Sub-cohort 1，应用Pearson相关性分析筛选与采样时间显著相关的蛋白质（p < 0.05），分为表达随时间增加的正相关蛋白和表达随时间减少的负相关蛋白。对于Sub-cohort 2，比较SSG与SNSG组的蛋白质表达，筛选出差异蛋白。
  • 随后对两组结果进行交集分析，筛选出既在动态变化中显著相关，又在SSG/SNSG组中差异表达的蛋白质，分别获得敏感标志物（S-sig）和耐药标志物（NS-sig）。
  • 通过逐步逻辑回归，从S-sig和NS-sig中选取关键蛋白质，构建预测模型，并在独立的血浆验证队列中测试预测模型的稳健性。

纵向结果解析

  • 根据患者对西妥昔单抗治疗的反应模式，分为逐渐耐药的Sub-cohort 1和始终耐药/不耐药的Sub-cohort 2。

  • 对于Sub-cohort 1，找到了表达随时间增加的正相关蛋白（139种）和负相关蛋白（374种）。对于Sub-cohort 2，比较SSG与SNSG组的蛋白质表达，分别获得341种SSG上调蛋白和235种SNSG上调蛋白。

  • 继而根据韦恩、K-means分析，找到了负相关蛋白与稳定敏感组（SSG-sig）蛋白质的重叠-敏感标志物（S-sig，29种蛋白），呈现随治疗时间逐渐下降的趋势。以及正相关蛋白质（Positive correlation-sig）与稳定耐药组（SNSG-sig）蛋白质的重叠-非敏感标志物（NS-sig，10种蛋白），呈现出随治疗时间逐渐上升的趋势。


  • 敏感标志物在SSG组中表达较高，并随治疗周期逐渐下降；而非敏感标志物在SNSG组中表达较高，并随治疗周期逐渐上升。这些动态变化反映了标志物与治疗反应的紧密关联。

  • 从S-sig和NS-sig中选取关键蛋白质，将Sub-cohort 2的样本按60%训练集和40%测试集做分配，在训练集上应用逐步逻辑回归，获得训练集AUC=0.756，测试集AUC=0.797，表明模型预测治疗反应方面区分能力佳。

  • 要证明预测模型在不同治疗采样时间点（1-7个疗程）的准确性。模型在整体治疗期间的最低准确率为0.724，在第二疗程（AUC=0.818）、第三疗程（AUC=0.737）和第四疗程（AUC=0.800）也表现出较高的准确性。这表明预测模型在多个治疗周期中均具备稳定的预测性能。

  • 在血浆纵向验证队列中，使用逻辑回归分类器区分敏感组（S）与非敏感组（NS）的分类误差矩阵。表明模型在独立验证队列中具有高准确性（首次疗程准确率=0.929，第二疗程准确率=1）


  • 在一个典型病例中，预测模型marker蛋白（S-sig和NS-sig）随治疗时间的动态变化。S-sig蛋白（包括MDN1、KLC4、IDH3G）在耐药出现时显著下降，并在后续疗程中保持下降趋势；而NS-sig蛋白（包括SBF1、HTRA3、MYL9）在耐药出现时显著上升，并在后续疗程中保持上升趋势。

  • 预测模型marker 蛋白表达量与治疗采样时间之间的Pearson相关性分析。S-sig蛋白与采样时间呈显著负相关（r = -0.78，P = 0.037），NS-sig蛋白与采样时间呈显著正相关（r = 0.8，P = 0.031）。这些结果与临床治疗反应评估（MRI影像）一致，进一步验证了预测模型的有效性和稳定性。
总结：通过细分纵向数据、进行交集分析及构建预测模型，纵向蛋白质组学能够有效识别和验证与疾病进展及治疗反应密切相关的关键蛋白质标志物。


最后这三篇的统一总结

纵向队列研究在蛋白质组学中往往通过多时间点的采样和动态监测来体现。很多小伙伴在做完纵向队列的蛋白簇，接下来再去分析各个簇的不同的功能通路，接下来就可能恍惚了，或者就开始继续上多组学了。还可以怎么做呢？

  • 细分纵向队列：根据患者的临床特征、疾病阶段和治疗反应，进一步细分纵向队列，挖掘更加特异和精准的生物标志物。帮助理解不同亚群体中的生物学差异。
  • 交集分析与功能验证：在识别蛋白簇后，通过交集分析结合临床数据，筛选出在不同条件下均显著变化的关键蛋白质。再利用功能实验和通路分析，验证这些标志物在疾病机制中的作用。
  • 典型病例与影像对应：通过纳入典型病例，并与影像学数据（如MRI）对应，增强预测模型的解释性和临床实用性。这不仅有助于验证模型的有效性，还能提供更直观的生物学意义。

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