文章：An optogenetic-phosphoproteomic study reveals dynamic Akt1 signaling profiles in endothelial cells. Nat Commun 14, 3803 (2023).

技术：使用光遗传学工具操控Akt1信号通路，并通过磷酸蛋白质组学技术、Spectronaut解析软件、生信与统计分析来解释内皮细胞中的磷酸化事件。通过使用不同光强度（3个水平）、模式（持续、周期性和脉冲3个方式）、时间（3个水平）的Akt1刺激，对细胞中的磷酸化蛋白组进行系统水平的分析，发现了一系列Akt1信号传导下游激活的信号通路。研究对大量数据进行分析和解释，从而加深对内皮细胞中Akt1信号传导的理解。

背景：蛋白质磷酸化的动态模式在细胞信号传导网络中起着关键作用。其中，AKT蛋白激酶是一个中心节点，调控多种细胞过程，如细胞生长、迁移、存活、代谢和血管生成等。尽管异常的AKT活化与多种人类疾病有关，但不同的AKT依赖性磷酸化模式如何决定下游信号传导和表型结果仍然存在许多未知。使用“自然”刺激（如生长因子）来研究AKT的动态调控具有挑战性。这是因为无法精确地控制AKT活性，并且这些刺激通常会同时激活其他多个信号通路，使得无法将影响归因于单独的AKT作用。


技术方案

文章提到这个技术：光遗传学-磷酸蛋白质组学DIA-MS实验系统（以下简称Optop-DIA），为了研究Akt1信号传导的磷酸化事件和时间动态而开发的，具体方法如下：

1 、通过控制光源来精确控制光遗传学Akt1系统的磷酸化事件

  • 构建光遗传学系统：共表达mCherry-CRY2-Akt1和CIBN-GFP蛋白，并将CAAX序列与CIBN-GFP融合。

  • 验证Akt1磷酸化：通过免疫印迹检测到蓝光刺激后Akt1的磷酸化位点T308和S473的信号。

  • 显微镜观察：使用共聚焦显微镜观察到蓝光刺激后mCherry-CRY2-Akt1快速转移到细胞质膜上。

  • 给予和关闭光源：观察Akt1的磷酸化水平动态变化

  • PI3K的作用：使用PI3K抑制剂LY294002降低了光诱导的Akt1磷酸化水平，说明光遗传学系统的磷酸化依赖于内源性PI3K活性。

通过以上实验证据表明，该系统能够通过控制光源来精确控制光遗传学Akt1系统的磷酸化事件，并观察到其动态变化。

2、选择合适的细胞、光照条件、控制模式

  • 选择合适的细胞：由于不同Akt亚型在表达模式和对磷酸蛋白质组的影响上存在差异，文章选择了以Akt1为主要亚型的内皮细胞（EC）进行研究。文章选用了EA.hy 926作为人类血管内皮细胞系进行光遗传学实验。

  • 根据实验结果选择最高光照条件：通过免疫印迹检测，文章发现增加光强度会导致Akt1磷酸化水平的逐渐增加，以及其下游底物eNOS和GSK3β的磷酸化。文章选择0.25 mW/cm²作为最高光照强度进行进一步研究。

  • 验证系统功能：通过检测一氧化氮（NO）释放量，文章验证了光遗传学Akt1系统的功能相关性。结果显示，在经过1小时0.25 mW/cm²的光照刺激后，细胞中的NO产生显著增加。

  • 光照条件的选择：根据之前的结果，文章使用0.05、0.10和0.25 mW/cm²（或简写为005/010/025）三个不同的光强度，分别代表最小、适中和高度激活的Akt1水平，对转染的EA.hy 926细胞进行光照处理。

  • Akt1激活模式的控制：通过控制光照，文章包括了三种Akt1激活模式：持续(Su)模式，在该模式下细胞持续接受光照；周期性(Pe)模式，细胞在5分钟的光照后再经过5分钟的黑暗，循环重复；脉冲(Pu)模式，细胞在5分钟的光照后进入黑暗。文章在第一个30分钟窗口内进行测量，并以10分钟为间隔采样。

  • 蛋白质组学分析：在经过最高强度和时间（即0.25mW/cm²照射30分钟）的蓝光处理后，并未观察到转染的光遗传学细胞中蛋白质组的全局变化。这是预料之中的，因为一般来说，常规的全局蛋白质组学分析需要几个小时才能检测到蛋白质表达的变化。因此，在后续实验中，文章没有对总蛋白质组进行测量，因为在30分钟的时间范围内，蛋白质水平的变化对磷酸蛋白质组学结果的影响较小。

  • 磷酸蛋白质组学分析：文章使用27种Akt1激活条件（3个光强度× 3个模式× 3个时间点），以全黑暗条件作为对照，对磷酸蛋白质组进行分析，并对所有条件进行了生物学重复。

  • 利用Spectronaut分析并保证了数据的可靠性和准确性，文章总共鉴定到了37,449个Class-I型磷酸肽，对应于5044个磷酸蛋白此外，文章还确定了34,740个可信度高的磷酸化位点，并在所有Akt1激活条件下进行了定量分析。与以前的磷酸蛋白质组学-DIA研究类似，生物学重复的结果显示出较高的皮尔逊相关性，平均为R = 0.943。在所有样本中，磷酸化肽的富集效率达到了98.4% ± 0.5%。


3、对p-Akt1进行进一步的定量分析

通过对p-Akt1进行深入的定量研究，文章可以获得关于Akt1磷酸化水平和活性的更具体信息。考虑因素为：检测不同样品和条件下的Akt1 pT308水平；进行脉冲实验验证，确认Akt1 pT308的及时去磷酸化，同时观察Akt1其他位点，如Akt1 pS473以及一些已知的Akt1下游磷酸化位点。

结果显示，XIC图显示010组和025组的Akt1活性分别相对于005组上调了3.4倍和7.1倍，这表明在不同条件下Akt1的磷酸化活性发生了变化。使用脉冲实验确认Akt1 pT308的及时去磷酸化，以确保所得结果的可靠性。成功定量了大约90%的样品中的Akt1 pS473，并观察到类似的趋势，检测了一些已知的Akt1下游磷酸化位点（如NOS3 pS1177，GSK3A pS21，FOXO1 pS319和AKT1S1 pT246），并观察到它们在不同条件下呈现出预期的调控模式。通过以上操作步骤，利用光遗传学方法实现了对Akt1的期望调控，并且通过DIA-MS技术捕获到了这些信息。这种设计和操作步骤能够提供关于Akt1磷酸化水平和活性更准确和详细的信息。

4、评估Akt1介导的蛋白质磷酸化的全局定量特征

使用主成分分析（PCA）对在所有条件下完整测定的31,488个P-位点进行分析, 究不同光照强度下的样本，并考察光照模式和持续时间对结果的影响。

通过PCA分析发现通过使用两个主成分，可以将最小光照强度条件（005）与中度和高度光照暴露条件（010和025）进行明确分离，而与光照模式和持续时间无关。此外，在每个光照强度组内部，无论光照持续时间（10/20/30分钟）还是光模式（Pe/Pu/Su），都不能将样本全局分类成明显的聚类。层次聚类分析（HCA）对这一观察结果提供了支持；

为了验证PCA和HCA结果，使用ANOVA分析方法对所有34,740个P-位点进行分析。在这个分析中，将光照强度、光模式和光照持续时间中的一个作为主要因素，其余两个作为协变量。结果验证了光照强度在这三个变量中具有最深远的影响。根据显著性标准（P< 0.01），确定了与光照强度、光模式和光照持续时间相关的分别有15,017个、1,136个和358个P-位点，分别对应总定量磷酸化蛋白质组的43.2%、3.27%和1.03%。 光照强度是主要决定P-位点变化的因素，其他因素（如光照模式和持续时间）对于解释P-位点的变化没有显著影响。这说明光照强度对于Akt1介导的磷酸化调控起着至关重要的作用，并且其水平的变化可能会在细胞内引发广泛的磷酸化事件。

为了解释光照强度对生物学过程的影响，文章使用配对的T检验来比较005/010/025三个光照强度组之间的差异显著的P-位点。根据这些差异将P-位点分成了五个特征簇，前三个簇体现为磷酸化程度上调，而后两个簇则为去磷酸化，且每个簇富集到的通路也各不相同。尽管Akt1的活化程度（即光照强度）似乎对整体磷酸化蛋白质组的异质性有影响，但通过配对统计分析发现，增加光照并不总是导致下游P-位点有相同的命运。因此，这表明还需要进一步研究来深入理解光照强度与磷酸化事件之间的复杂关系。

5、P-位点模糊C均值聚类（FCM）分析、比较不同聚类簇中P-位点的序列特征和功能

为了关注对Akt1最敏感的P-位点，筛选了1873个在Pe025组中连续三次周期激活中被上调超过1.5倍的Akt1激活的P-位点。在脉冲条件（即Pu025）下对这些P-位点进行模糊C均值聚类（FCM）分析。FCM将这些P-位点划分为四个簇（fC1-fC4），每个簇展示不同的行为特征。例如，第一个簇fC1包含Akt1 pT308和P-位点，它们在p-Akt1水平调节下迅速变化；第二个簇fC2代表随着p-Akt1去除而降低，但相对于fC1有延迟的动力学；第三个簇fC3显示持续的磷酸化，尽管在30分钟内有一定程度的降低；第四个簇fC4则在整个时间范围内呈现逐渐上调的趋势。

为了比较不同聚类簇（fC1-fC4）中P-位点的序列特征和功能，采用Motif富集分析、P-位点进行注释和富集分析，发现与Akt1底物基序（R-x-R-x-x-S*/T*）相关的Motif在fC1中富集。而fC3和fC4则富集了与MAPK（ERK、p38、JNK）、CK2和CDK等其他激酶相关的Motif。经过功能注释在fC1簇中发现了一系列类别的富集，包括AKT和PRKACA（PKA）的底物。而fC2和fC3仅在EGF诱导和RPS6KA1底物方面显示出适度的富集（P= 0.0369和0.0178，Fisher的精确检验）。值得注意的是，fC4簇中的P-位点富集于CK2α1（CSNK2A1，P = 0.0478）、CDK1（P = 0.0183）和CDK2（P = 0.0316）。这些结果与Motif分析基本一致。

网络重建和综合分析：使用PHONEMeS和PhosR等工具进行整合的磷酸化蛋白质组数据分析，以进一步理解短期p-Akt1激活后的顺序信号传导事件。通过考虑PhosR中实验中所有条件下激酶的经典底物动态剖面，PHONEMeS识别出连接fC1-fC4簇中受调节的P-位点与共调控激酶之间关系的路径。重建的网络表明，短期Akt1刺激激活了一系列具有可变时间模式的潜在激酶。

因此，在脉冲条件下的Optop-DIA数据揭示了短期Akt1刺激引发了高度有序的时间相关的磷酸化过程，这些过程承载着不同的磷酸化功能。


通过Motif分析、注释和富集分析，以及网络重建和综合分析，瞬时的Akt1底物磷酸化足以诱导特殊的一系列的P-位点的持续磷酸化，这些位点可能是MAPK、CK2和CDK等激酶的潜在底物。


总结


1、基于质谱分析的DIA-MS技术再加上软件发展，使得DIA-MS可以进一步分析翻译后修饰（如磷酸化）等蛋白质修饰。

2、通过使用不同光强度（3个水平）、模式（持续、周期性和脉冲3个方式）、时间（3个水平）的Akt1刺激，对细胞中的磷酸化蛋白组进行系统水平的分析，发现了一系列Akt1信号传导下游激活的信号通路。研究对大量数据进行分析和解释，从而加深对内皮细胞中Akt1信号传导的理解。

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