在虎年，灵敏度、高通量、高可靠性：全都要！

在虎年，灵敏度、高通量、高可靠性：全都要！

在nano LC-MS/MS的世界里，在细胞中稳定的每小时检出10000个PG的小目标不容易实现，而能够连续一个月以上保持稳定更加可望而不可即。虽然很多学术会议上不时地有大佬秀出自己nb的数据让大家觉得高山仰止，自己好像也行，但相信很多人默默地回到实验室看看自己的数据还是只能叹口气。

而我一直坚信，这个小目标早晚能实现，今天我们为您带来最新的实践结果。

下图是我们设计的蛋白质组质控完整流程，分别针对样品取样、蛋白提取、色谱质谱状态、定性定量结果 不同方面的全流程质控路线。

需要用到的前处理方案，标准品，色谱柱，质谱方法，检索工具，qc算法我们一一慎重选择，做成了相关方案早已发售，既方便自己测试也方便客户的落实，本次测试核心平台为最新款的Bruker TimsTOF Pro 2，采用DIA-PASEF定量。

很多时候的卖家秀和卖家秀天差地别，因此首先我们先考察一波PPT和实测的一致性（部分体系略有出入）：

对比结果显而易见，官方数据可以复刻成功，为布鲁克点赞。而且可以看出基于DIA-PASEF技术的结果在30分钟梯度中能够实现DDA-PASEF 90分钟的检测深度。实现每小时定量10000种蛋白的目标似乎唾手可得。

我们在阅读文献的时候，可以发现最简单也是用的最多的大队列稳定性指标是基于标品蛋白数量评估，但实际上仅凭蛋白数来说明问题非常的不全面，我们的目标是深度、通量、可靠性缺一不可，可靠性（robust）可是蛋白质组被人诟病的一大缺点，我们会考察在实验跨度1个月以上，系统维护一次、色谱柱更换一次、液相流速微调后的前后一致性。评价方式是每隔几天进样hela标品采集35分钟梯度DIAPASEF数据，其他时间全部满负荷实际样品测试，共进样500+个，包括细胞、组织、植物、体液、古代牙齿、IP溶液等，然后更换第二根色谱柱，再观察两根色谱柱的分离一致性。以证明蛋白质组LC-MS技术的高可靠性并非难以实现，即使更换了色谱柱、微调了流速也能保证大队列实验的可靠性。

测试指标如下：

首先在没啥难度的蛋白数量上可以看到波动<3.5%。数量和稳定性符合预期。

蓝色为质谱维护并更换第二根色谱柱后2月12日TIC，信号略微增强，其他为第一根色谱柱。

定量热图可以看出，归一化后更换流速及色谱柱总体定量分布没有区别。

蛋白定量相关性R²，可以看到随柱子使用时间变长以及更换流速和色谱柱，相关性略微下降。

那这个相关性到底算好还是不好呢？我们找来一篇Cancer Cell的质控标品数据，差不多4、5天测一次质控（放这个信息的文献真的不多，可一顿好找）

更换色谱柱前后，多肽定量一致性R²=0.96

整体定量CV约为12%（更换色谱柱，更换流速还是略微增大了CV）

缺失值的比例也是大队列定量的一个重要考察对象，临床实际样品出现缺失值很大可能是因为个体、样品采集、保存差异等引起的，所以我们检测标品的缺失值主要考察的是色谱质谱系统的长期稳定性。

在一共7个run的蛋白水平整体累积缺失值为3%，肽段水平整体累积缺失值为10%。

在质谱保持稳定的情况下，色谱的稳定性往往成为关键因素，也是容易被忽略的地方，没有色谱柱高效稳定的工作，质谱也是巧妇难为无米之炊。我们很少在文献中看到有测试大时间尺度上保留时间的一致性，而往往我们要进行PRM/MRM验证的时候，又为保留时间窗口的设置而大为头疼。由于色谱柱是耗材，一般1、2个月就要更换，纳升级别色谱柱又较为金贵，很多研究者都喜欢自己填色谱柱进行低成本替代。那高稳定高性能的色谱柱究竟能做到多高精度呢？我们在色谱柱柱效、FWHM仅仅下降3%左右的时候更换了新的ionopticks色谱柱，来进行前后一致性对比。

对比方式为选择所有run，所有定量多肽的RT APEX值，计算在所有样品中同一条多肽的RT APEX偏离标准差。

第一根柱子1个月内的多肽出峰时间标准差，横坐标为RT，单位为分钟，纵坐标STDEV，可以看到除了刚出峰的时候偏差略大，绝大多数时间的STDEV在0.1内，总体RT标准差为0.03。

将两根柱子放在一起比较可以看到，STDEV有明显增加，但总体偏移平均值为0.18。不过不到0.2分钟的漂移对于我们进行大队列或PRM验证设置非常窄的窗口来说也是轻而易举。

经过我们1个多月的考察，对于大队列蛋白质组研究来说，无论是定性还是定量的数量，一致性，甚至于最难确保的保留时间一致性，在目前最新的体系方案下也基本达到了我们的高标准、严要求，所以您要是打算进行大队列蛋白质组研究的话，向我们了解整体解决方案将是您事半功倍的最佳选择哦。