基于SpectroDive的标准曲线建立

这一节，我们回答的问题是：

1.标准曲线建立的流程

2.相关参数说明

3.标曲数据采集的要求

在软件的Analysis功能界面，如图所示依次选择：

Set up a targeted analysis→ Select raw data → Assign Panel → Select Panel → Load → Next → Select Settings → Calibration Curve → select Process as Calibration Curve → Select Determine Quantification Range → Next → Specify peptide information → Specify conditions for each calibrant replicate → Next → Finish

按照以上步骤依次选择标曲raw文件、对应Panel、在Setting中勾选Process as Calibration Curve，并设定定量范围，点击finish后即可创建标曲。

1. 标曲构建相关参数设置

Calibration Curve下指定标曲创建的相关指标，如LLOQ、LOD、outlier的剔除等。

需要注意的是，Concentration variation on peptide type的设置，如果我们标准品为重标同位素肽段，那么此处则选择“Heavy peptide”，因为重标肽的浓度在各个稀释条件下是变化的。

如果标准品是不带同位素标记的轻标，即采用外标法进行定量，则此处则选择“Light peptides”。

简单来说就是哪一个通道浓度是变化的就选择哪一通道。

默认的workflow为Spike-in（即掺入重标肽的定量实验）：

则标准品含有同位素重标，该流程下，默认Heavy channel作为Reference，峰识别会基于Reference进行。Reference based identification需勾选，此种条件下定性基于重标通道。

如果合成非标的普通肽段，基于外标法进行定量，则Multi-Channel Workflow Definition指定为From Panel Annotation（Panel为Label free panel），Reference based identification不勾选。

此处进行数据对应浓度梯度的设置，相同浓度点的数据指定到同一“Condition”。Dilution Factor列指定稀释倍数，需要注意的是，blank组的Dilution factor设置为0，最高浓度点的Dilution factor设置为1，其他组根据稀释倍数依次设置Dilution factor。以上图为例，以2倍梯度进行稀释，浓度从高到低对应的Dilution factor则为1，2，4，8，16，32......128。

设置完成后，可同通过左下角“Export Condition Setup”保存设置文件，以便于后期重复分析此项目时可以直接调用（通过Import Condition Setup直接导入保存的设置文件即可）。

1. 至少采集7个数据点

2. 每个点至少采集两针

3. 要采集blank，即没有掺入重标肽的基质组，blank建议采集三针