当我们通过LipMS或者计算模拟后得到靶标候选分子后,就需要进行相关的验证实验。而Biacore:Biomolecule Interaction Analysis core 技术则是用于验证两个分子间的互作亲和力的最佳方法。

技术原理

Biacore是基于SPR原理研究分子间相互作用的技术。把分子固定到芯片上,另一个分子流过芯片表面,检测这两个分子直接的相互作用。如果两个分子之间有结合,芯片表面发生质量数的增加,产生结合响应信号。结合信号与结合质量成一定比例关系,Biacore可检测到芯片表面每平方毫米pg级的变化。停止进样时,两个分子之间发生自发解离,引起芯片表面质量数的下降,产生解离响应信号。

该技术核心是表面等离子体子共振( surface plasmon resonance , SPR),一种物理光学现象。在发生全反射的界面涂上一薄层金膜(或其它金属膜)约50nm厚。一束偏振光在一定的角度范围内入射到棱镜端面,在棱镜与金属薄膜(Au或Ag)的界面将产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数相匹配时,引起金属膜内自由电子产生共振,即表面等离子体共振。

  • 全内反射的条件下,入射光造成薄金层等离子体发生共振,导致反射光在某一特定角度(SPR角)能量低至几乎为零

  • 分子间可逆的结合/解离造成金膜附近折光率的实时变化,导致SPR角的变化,这一现象被biacore实时记录

检测能力

    相对于LiPMS这类非靶向技术,Biacore需要得到纯化后的检测对象;

    相对于LiPMS可以检测活性位点,Biacore只能检测是否存在互作及其亲和力;

  • 在芯片上固定目标蛋白A作为配体偶联在芯片表面,然后将待测物:蛋白、多肽、小分子、RNA、病毒等流过芯片表面,若样品中有能够与芯片表面的生物分子相互作用的分子,会引起金膜表面折射率变化,最终导致SPR角变化,通过监测SPR的角度变化,获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性。仅对检测样品纯度有要求,其分子量无特殊要求。

研究对象选择

类目

样品要求

蛋白与小分子互作

蛋白浓度>200ug/ml,体积大于100ul(按照最低浓度估算);提供小分子分子量和结构式,小分子尽量提供粉末样品,提供小分子溶解信息,能否用水或DMSO溶解,DMSO溶解浓度≥10mM,水溶解浓度≥1mM。

蛋白与蛋白互作

抗原抗体互作需特别说明;配体蛋白浓度>200ug/ml,体积>100ul(按照最低浓度估算);分析物蛋白浓度>200ug/ml,体积>500ul(按照最低浓度估算)。

蛋白与核酸互作

核酸需用Biotin标记,浓度≥100nM,体积>50ul(按照最低浓度估算);蛋白浓度>200ug/ml,体积大于500ul(总量>20ug)。

蛋白与其他互作

蛋白-细胞表面互作细胞不能大于30μm,其他个性化测试,提供分析物性质、浓度和分子量等信息,根据样品特点定制方案。

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