在2020年ASMS期间，我们迎来了新版本的Spectronaut，界面依旧，操作方式不变，很多用户可能就下意识的跳过了升级。
那么实际情况是否如此呢？今天我们带来了Spectronaut 14的全方位对比测试，宣告机器学习加持下的Spectronaut14完全能够为你的定量蛋白质组数据插上翅膀，起飞！
关于已知的更新内容您可以参考我们前几期公众号介绍：
新算法、离子淌度全面对接，Spectronaut 14升级到来
那么今天就给大家带来以下几个方面的评测结果：
DDA定性及分级建库
directDIA定性提升及定量准确性
磷酸化DIA
搜库速度
以下所有评测均基于Precursor/PSM，Peptide和Protein Group均1%FDR最严格标准进行。
DDA定性及分级建库
早期DIA分析建库都会采用相同样品多次DDA采集进行，但经过长期实践后，大部分研究者都发现该方法对提升鉴定率的帮助很小，故现在越来越少使用了。不过SN14对单针DDA的定性结果提升也可以让我们看到全新算法对常规检测数据分析也大有帮助，我们不一定做到DIA的时候才能想起Spectronaut，常规定性DDA分析的时候我们的软件也将是你的一大助力。
测试数据1
基于Bruker Timstof Pro Hela 1小时检测定性 7069Protein Group（实采数据，非官方，非Mann数据）
测试数据2
基于QE HF-X的Hela分级检测，SN14相对SN13提升16%的PG，17%的肽段（除版本外其余分析参数和质控指标完全一致）
测试数据3
在Mann最新的关于蛋白质组全景数据库的文章中
他采用了14种人细胞系共得到了12005个Protein Group
同样的数据，同样的fasta文件和质控标准，spectronaut14中构建了近14000个Protein Group的谱图库，提升16%
在保持相同分析平台、质控标准的情况下，我们为您实现了通过软件升级实习质谱升级换代的效果。
测试数据4
大家可能会问，DDA建库提升那么多，是不是一定得DIA实验才能用的上呢？
答案是否定的，我们测试了一套易算客户采集的鼠脑TMTpro16标数据以证实这一点。
质控标准一致，首先采用Proteome Discoverer 2.4 我们检测得到了
而在Spectronaut中，相同数据库和质控标准
我们也实现了3%的PG，4%的肽段提升，当然，如果需要进一步TMT定量，您得在SpectroMine中继续进行定量分析（SpectroMine可以看做是Spectronaut的DDA数据分析版本）。
在Biognosys的官方测试中，单针10000Protein Group已然不再是难于上青天了。
详见 https://biognosys.com/media.ashx/mp131rolandbrudererasms2020.pdf
数据集4
同样在TimsTof的DIAPASEF数据比较中，也可以得到定性结果的巨大提升和定量准确性的保证。
如您需要亲自测试，以上数据集2、3均可向易算索取，数据集1、4请联系布鲁克公司。
directDIA定性提升及定量准确性
早先我们提到新版本的机器学习算法大大提升了DirectDIA的分析效果。Biognosys官方给出的结果定性提升17%PG
定量准确性也得到提升
眼见为实，我们选取了Biognosys 2019年的TMT和DIA定量测评文章的数据进行再测试
该文章采用混合物种定量以评价定量技术以及同源肽段的干扰下的定性、定量能力。
上表中第2到第五列为原文献结果，我们可以看到，相对来说DIA（单针不分级）的定量数量、missing value都略差与TMT（分级）一筹，而在新版本加持下，Library实现了26%的巨大提升，基于Library的DIA定量数量也超过了原本的TMT数据，missing value略微提升。而directDIA的结果仅仅少于新版本Library定量结果4%，同样超过了TMT定量结果，而missing value仅仅高于TMT数据0.4%。UPS2蛋白的检测数量已然超过TMT。
再看定量准确性
上图为标准蛋白掺入比例，S5约为S1的7.33倍。
上图为文章原图，蓝色为Library DIA定量比例，黄色为TMT定量比例，在原结果中我们可以看到DIA已然相对于TMT更加准确。
在新版本中，我们发现DirectDIA的定量一致性更胜一筹，同时检测灵敏度也高于TMT方法。（纵坐标为定量结果的log2 Ratio分布，横坐标为S1-S5分组比较，与文章原图比较方式相同。可以看出新版本DirectDIA不仅提升了灵敏度，降低missing value同时进一步提升了定量准确性。
磷酸化DIA
目前翻译后修饰定量越来越受到关注，尤其是大量临床样品如何更好地进行磷酸化定量是很多研究者头疼的问题。
测试数据1
我们重新用SN14分析了Olsen的同一数据
和他用的旧版本Spectronaut结果相比，实现了45%的肽段水平和33%的Protein Group水平的结果提升，可谓惊人。从而可以宣告在仅仅18分钟梯度的磷酸化DirectDIA检测中实现单针22000条磷酸化肽，合并检测29167条磷酸化肽的结果。（以上均过滤位点置信度Prob>0.75，与文献一致）
可以看到新版本Spectronaut的directDIA磷酸化定量实现了远超Maxquant DDA，持平旧版本分级建库的结果。而我们客户抱怨最多的，就是实际研究中富集不到足够量的磷酸化肽去做DDA分级数据库，那么现在您还有这个疑虑么？
当然有人会说大佬数据看看就好。为了证实大佬可以，我也可以这个梦想，易算的忠实用户也为我们提供了其未发表的磷酸化结果进行对比测试，证明了磷酸化DIA的无限前景。
在2小时梯度的磷酸化DIA检测中，定量到近40000条磷酸化肽
同时在3个不同细胞系各3次重复的directDIA磷酸化定量测试中，实现了高度可重复的定量结果
样品间结果一致性非常理想
组内定量CV仅10%
两相验证，我们可以非常确信的告诉用户，磷酸化DIA定量现在轻而易举。
搜库速度
大规模定量实验一个让人头疼的问题就是往往数据分析耗时耗力。
Spectronaut14中尽管加入了机器学习算法，但其分析速度并未受到影响。
在我们的实测数据中，基于library的DIA分析速度依然实现了约5-6分钟/文件。DDA建库，3小时HF-X 15-20分钟/文件（Mann Nature）。DirectDIA常规蛋白定量30分钟/文件，磷酸化定量1小时/文件（120分钟 FAIMS 480 多CV)。以上数据均基于2年前上市的桌面级i9 9980CPU实现。而对于超大规模（>10000个样品）的DIA定量分析，Spectronaut也有其分块式解决方案，完全不需要使用靡费巨大的集群、服务器等配置。
综上所述，我们认为，2020年的定量蛋白质组学研究，除非您追求极致深度挖掘（10000个蛋白以上的定量）还是需要采用TMT方法，其他情况下，DIA技术，尤其是基于Spectronaut14的DIA检测技术可以完全替代其他方法成为您实验室的标配。
如果您对DIA定量技术有进一步咨询或者需要易算生物为您打造全套高通量定量体系。那就心动不如快行动啦。
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