1.1 上传你的数据集-基本操作

分为三个步骤。

第一步：点击打开数据载入页面：

在这个页面选这五项内容：

1.1）物种（Organism）：选择您的待分析的物种。iPathwayGuide 支持对人类、小鼠和大鼠数据的分析，这些物种我们提供最佳注释。

一旦需要分析来自其他物种的数据，我们建议您将感兴趣物种的基因，转换为直系同源的人类、小鼠或大鼠基因。

 1.2）文件中包含哪些数据（what data is included in your file）：选择要分析的数据类型。iPathwayGuide 允许您输入 (a) 来自实验的整个数据集，包括差异表达和非差异表达的基因或 (b) 感兴趣基因的子集。

请注意：为确保背景正确，我们强烈建议您上传实验中检测的所有基因的差异表达数据，包括差异表达的基因和非差异表达的基因。阈值可被用于从比较页面的总集中选择DE基因。

1.3）文件格式(File Format)：选择您的文件格式。

文本文件(Text files)：通常，iPathwayGuide 设置为识别带有以下列的制表符分隔的文本文件：基因符号（Gene Symbol）、Log2 倍数变化（Log2 Fold Change）和矫正后的 p 值（Adjusted p-value ，FDR 或 q 值）。如果您的文件有这些列，您可以使用制表符分隔的“*.txt”文件格式：

注意：使用自定义选项，一旦您的数据文件被上传，请选择数据类型是 RNA 还是蛋白质，并定义基因符号、倍数变化和 pvalue 的列。

iPathwayGuide 可识别以下作为生物信息学软件标准输出的文本文件格式：

CuffDiff：以“_gene_exp.diff”结尾的输出文件

DESeq：以“results”导出的制表符分隔的文本 (*.txt) 文件，其中的列包括：base means across samples, log2 fold change, standard error, test statistic, p-value, adjusted p-value

EdgeR：以“topTags”导出的制表符分隔的文本 (.txt) 文件，其中列有：gene（列标签可能为空）、logFC、logCPM、PValue 和 FDR

GEO2R/Limma：制表符分隔的文本 (*.txt) 文件

JMP Genomics：从JMP Genomics 中选择 iPathwayGuide按钮

nSolver (NanoString™)：从nSolver 导出的制表符分隔的文本 (*.txt) 文件，其中包含以下列：gene symbol, logRatio, and p-value

Sciex SWATH 蛋白质组学数据：来自 Sciex Protein Assembler 或 Sciex Protein Expression Workflow 的逗号分隔文件“foldchange.csv”

此外，iPathwayGuide 可识别Affymetrix 原始数据集（.cel 文件）

Afffymetrix .cel 文件：iPathwayGuide仅接受以下平台

人（Human）Human Genome U133Human Genome U133A 2.0Human Genome U133 Plus 2.0Human Genome U95Human Genome U35K

小鼠（Mouse）Mouse Expression Set 430Mouse Expression Set 430 2.0Mouse Genome 430A 2.0

大鼠（Rat）Rat Expression Set 230Rat Genome 230 2.0Rat Genome U34

1.4）数据类型（Data Type）：选择您的数据类型。

Gene expression/Transcriptomics

mRNA (RNA-seq)

total RNA (RNA-seq)

mRNA (microarrays)

mRNA (Nanostring)

Proteomics

protein (mass spec)

protien (Nanostring)

phosphor-protein

Epigenomics

ChIP-seq

ATAC-seq

RBRS

Hi-C

Methylomics

Other

User-defined data type

1.5）文件（File）：上传您的数据集

选择“Browse”按钮以选择您的数据文件。

自定义文件一旦上传，你需要定义基因列、表达变化（logFC）、差异表达P值所在的列。

注意：iPathwayGuide 可分析：

基因、对数倍数变化和 p 值

基因、对数倍数变化（无 p 值）

基因（没有对数倍数变化或 p 值）

但是请记住，在没有对数倍数变化的情况下，输入数据无法计算影响分析（impact analysis），只能进行富集分析，这会影响分析结果。出于这个原因，我们强烈建议尽可能附上表达的变化。

参考集（reference set)：选择您的参考集。

您必须选择一个参考集以便 iPathwayGuide 来进行基因富集计算。参考集可以是用户选择的一组自定义基因，或整个转录组。如果您选择自定义，系统将提示您输入包含参考集的文件，并且必须定义包含基因 ID 的列。这个集合必须包含被分析的基因并且大于被分析的集合。

如果选择“转录组/蛋白质组中的所有基因/蛋白质（all genes/proteins in the transcriptome/proteome）”，将使用 Advaita 知识库中的参考集列表分析基因集。

选完参考集，就可以点击“Upload”

第二步：数据上传后，将显示“Report Intake Form”表单以收集其他信息。

除了数据的描述，你需要告诉iPG比较标签（比如caseVS control）、阈值。

2.1）报告标题（Report title）：提供描述性标题。例如：“肿瘤与正常乳腺癌实验#2。”此标题将显示在您的dashboard上。如果您有一系列的比较，我们建议您使用特定编号来命名，以便于区分。

2.2）报告描述（Report description）：提供实验的描述。本节对于为分析提供背景很重要。对于将与同事共享的报告，我们建议您提供足够的详细信息，以便他们了解所有实验条件。

2.3）对比（Analyze Contrast）

为您的对比提供标签。例如，条件可能是“肿瘤”，而对照可能是“正常”。对于某些文件格式，将从输入文件中自动检测对比标签。与报告标题一样，如果您有一系列，我们建议您使用特定编号来命名，以便于区分。

请注意，报告标题、报告描述和比较标签可以在报告生成后进行编辑。

DE 阈值：设置最合适的阈值来为您的实验识别 DE 基因。倍数变化（log）：默认值 0.6

iPathwayGuide 一般认为你输入为 log2 格式，log2(0.6) 的默认阈值相当于实际大约1.5 倍变化。iPathwayGuide 假设基因变化增高或降低都是有用的，因此我们使用所选阈值的绝对值来识别 DE 基因。

调整阈值：您可以选择使用较低的阈值（例如选择 0.4 的阈值）来识别更多的差异表达基因，或使用较高的阈值（例如 0.8）来识别较少数量差异表达基因。在您的实验数据中，如果已经包含对照基因（例如，一个或多个已知感兴趣的基因），这会给你调整倍数变化阈值时非常有帮助。如果没有可用的对照，则 log2(0.6) 的默认阈值对于大多数实验来说是一个合理的值。

调整后的 p 值（错误发现率或 q 值）：默认值 0.05

p 值（统计显著性）用于控制假阳性率。iPathwayGuide 假设输入值已针对您在实验中完成的假设检验次数进行了校正（例如，从 p 值转换为错误发现率或 q 值）。

与log2表达变化阈值一样，如果合适，您可以根据您的实验条件调整 p 值阈值以控制严格性。

第三步：按下按钮将提交文件进行分析。每个对比通常需要 10-15 分钟来分析。一旦完成，你可以通过邮箱，分享给任何人。