DIA定量技术入门之三：如何设计并建立SWATH-MS实验?

摘要：许多个性化医疗、药物筛选或系统生物学领域的研究课题高度依赖于能对海量生物学个体样品进行准确而高度一致的定量蛋白质组学数据。SWATH-MS是DIA(数据非依赖采集技术）的一个特定子类，目前已逐步展现出能够同时满足蛋白质组深度覆盖和定量高准确性、高一致性要求的能力。在一次SWATH-MS检测中，样品中质量在一定范围内的所有多肽被系统性的、无偏向性的方式以较宽的母离子窗口进行隔离并碎裂。为了分析SWATH-MS数据而开发的肽段为中心打分算法依赖于以先验的肽段色谱及质谱特性知识构建的谱图数据库及其肽段比对参数。本指南将介绍如何设计并建立一套SWATH-MS实验，如何进行质谱检测及如何进行数据分析。然后将介绍如何改进SWATH-MS数据采集流程，如何权衡相关参数设定及各类数据分析策略。

关键字：数据非依赖采集（data-independent acquisition）; 质谱仪（mass spectrometry）; 定量蛋白质组学(quantitative Proteomics); SWATH-MS; 系统生物学(systems biology)。

在过去的十年间，液相色谱联用串级质谱（LC-MS/MS）已经成为高通量蛋白质标准和蛋白质组学分析的首选技术 (Aebersold & Mann， 2016)。该领域最近已经逐渐从解析几个样本中的蛋白质、肽段或翻译后修饰发展到数百个样本大规模、高质量且高重复性的定量组学。尤其在个性化医疗，生物标志物研究，药物筛选，基因相关研究或系统生物学研究中，大量不同状态、处理的个体样本需要进行生物学意义的挖掘。就这个目的来说，大规模定量数据的产出必须首先尽可能的可重复，完整而准确。近年来多个蛋白质组学检测技术就是为满足这样的需求而进行研发的。

其中的一个亮点就是本文介绍的由Gillet et al (2012)全部理论质谱谱峰顺序窗口采集技术（SWATHMS）。对于该技术的历史背景，我们已在上两篇微信推文中有详细的介绍，不再赘叙。除了SWATH-MS外，还有一系列其他DIA方法和分析策略，我们也已进行了简介，并且你在最近其他的一些综述里也能看到 (Chapman et al， 2014; Bilbao et al， 2015)。没有看到的小伙伴，可以点击了解一下哦

DIA定量技术入门之一：DIA和SWATH-MS的“历史渊源”

DIA定量技术入门之二：SWATH-MS的“那些事”！

目前Sciex公司注册“SWATH”作为商标，应用于Q-TOF系统柜，Bignosys公司注册了 “Hyper Reaction Monitoring” (HRM) 作为Orbitrap系统上的应用商标。本文我们暂时用SWATH-MS来替代各类相似策略作为统称。而“DIA”则代表了这项数据采集技术本身。

SWATH-MS的主要优势在于其可以在保证高稳定性和精确性的情况下定量数千个蛋白质。因此它非常适合于需要对大量样本进行蛋白质组或多肽组精确而可重复定量的研究。典型的应用研究诸如生物标志物研究 (Liu et al， 2014; Muntel et al， 2015; Kulkarni et al， 2016; Ortea et al， 2016)，基因相关研究 (Liu et al， 2015; Okada et al， 2016; Williams et al， 2016)， 药物/干扰组学研究 (Litichevskiy et al， 2018; Tan et al， 2017; Keam et al， 2018) 或探索性基础研究 (Collins et al， 2013; Lambert et al， 2013; Parker et al， 2015a; Schubert et al， 2015b)。 SWATH-MS 同样特别适合用于快速短梯度检测研究 (Vowinckel et al， 2018)。并能够单针检测就实现在复杂哺乳动物样本中约50%的蛋白质组覆盖率 (Bruderer et al， 2017; Kelstrup et al， 2018)。目前SWATH-MS相对于传统靶向蛋白质组研究(SRM or PRM)的劣势依然在于其灵敏度依然只有它们的1/3到1/10 (Gillet et al， 2012; Liu et al， 2013; Schmidlin et al， 2016)。因此，靶向数据采集技术依然是对低丰度蛋白和多肽高精度定量的最佳选择。另一个SWATH-MS相对于DDA技术的缺点在于其必须要先建立参考谱图数据库并需要对方法进行优化。在当前大规模的定量蛋白质组学研究中，有两项技术同样表现出色。第一个是基于DDA的非标记定量技术，其定量依据来自于母离子的信号强度或者谱图数量，且该方法可以结合色谱分级技术实现更高的蛋白覆盖度 (Lawrence et al， 2015; Geyer et al， 2016; Frejno et al， 2017)。MS1定量技术实用化的一个主要技术进展是其数据分析工具对定量数据矩阵进行定性结果的跨样本匹配 (Prakash et al， 2006; Mueller et al， 2007; Cox et al， 2014)。不过就算采用了该方法，DDA数据集的缺失值依然高于SWATH-MS模式，尤其在定量较低丰度蛋白质的时候 (Bruderer et al， 2015， 2017; Kelstrup et al， 2018)。虽然直接比较MS1/DDA非标定量技术和SWATH-MS技术存在一定的困难，但也有多篇文献采用了同一个样品同时进行DDA和SWATH-MS检测的比较，并发现SWATH-MS在肽段检出量，定量可重复性上优于DDA(Bruderer et al， 2015; Kelstrup et al， 2018)。第二个流行的大规模定量蛋白质组策略是同位素标记，比如tandem mass tags(TMT) (Thompson et al， 2003)或 isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) (Unwin et al， 2005)。标记定量通常需要对肽段进行预先的分级处理，然后每个分级产物分别进行DDA质谱检测(Chick et al， 2016; Roumeliotis et al， 2017)。在TMT10标记或11标记中(McAlister et al， 2012)， 不同样品进行混合并同时上机检测，能够减少样品制备中的误差并提高样品间定量的一致性。这种方法也有一定的缺陷，比如由于共流出和共碎裂肽段导致的报告离子定量压缩效应，虽然也有一些优化的数据采集和分析方法进行了改进，但还是不可避免这个问题(Ting et al， 2011; Savitski et al， 2013; McAlister et al， 2014; Ahrne et al， 2016; O’Brien et al， 2018; Sonnett et al， 2018)。同位素标记适于中等规模的蛋白质组定量研究，但如果样品有数百个的话，其数据的完整性和批次效应会被放大导致标记批次间的一致性变得很差。目前暂时还没有直接在大规模样本水平比较同位素标记和SWATH-MS的文献。

本文我们主要介绍SWATH-MS的实验流程建立，DIA质谱方法建立和数据分析。后面我们还会进一步介绍如何改进SWATH-MS实验，哪些参数是需要权衡的，以及有哪些不同的数据分析策略。

如果您的SWATH-MS研究需要分析上百甚至上千个样品，那么需要特别想好如何获取可重复高质量数据，包括单个样品的检测时间以及是否要在多台仪器甚至多个不同型号仪器上同时采集同一类样本。目前令人振奋的是在不同实验室产生的同一套样本的SWATH-MS 数据具有较好的一致性(Collins et al， 2017)。（译者注：当然最好避免在不同地点不同型号仪器上采集数据并进行整合，因为这类研究除了质谱外，其他处理和分离条件需要有个共同的严格流程才能实现较好的重复性）。

诸如脂类、聚合物或去垢剂在质谱中的累积是影响质谱表现的一个重要因素，且需要我们极力避免。SWATH-MS实验中污染物的影响尤其严重，我们能够观察到该类实验中由于污染导致的在SWATH-MS中相对于DDA或PRM更快速的灵敏度降低过程 (比如电荷效应和灵敏度问题)。一种解释是SWATH-MS模式下质谱引入了更多的碎片离子（>90%的数据采集时间），从而导致更多的污染物和其他杂质进入系统。因此，监测质谱性能并维持其相对稳定的表现状态是及其重要的。最近一些软件（如Biognosys的QUIC）已经致力于监控SWATH-MS的色谱质谱表现了(Rudnick et al， 2010; Wang et al， 2014; Bereman et al， 2016;Chiva et al， 2018)。当你在设计一套大规模非标记定量蛋白质组实验的时候，需要考虑实验设计的统计学因素，诸如分组规模，生物学及技术重复的变异度或可达到的灵敏及选择性 (Krzywinski & Altman， 2014b)。为了保证下游数据分析合理的统计效力(Krzywinski & Altman， 2013)，我们建议重点考虑样本检测的随机化和区组设计 (Krzywinski & Altman， 2014a)，足够多的生物学和技术重复 (Blainey et al， 2014)。

SWATH-MS所基于的分析理念是关于目标肽段的色谱、质谱特性先验知识可以以靶向匹配的方式提取高度卷积的SWATH谱图中相应的肽段特征信息 (Gillet et al， 2012)。这所需要的先验知识被称之为 “peptide query parameters” (PQPs)。需要注意的是 “prior先验”在这里的含义指的是PQP是需要在SWATH数据分析前先获取到的。PQP包含哪些信息呢？具体来讲：(i)已知蛋白所能检测到的相应肽段序列， (ii) 该肽段主要母离子的m/z值及其电荷分布， (iii) 当前仪器状态下该肽段最高丰度的4到6个碎片离子的m/z值， (iv) 当前仪器状态下肽段碎片预期的分布模式，如相对碎片离子强度和 v) 该肽段预期的保留时间及相应的碎片离子信号并与参照品进行归一化。PQP通常可以从谱图库中获取[也可以用色谱库 (Sharma et al， 2014)] ，并以表格形式储存，如图1。

图1 PQP信息包含肽段的色谱和质谱特性，比如这边展示的肽段AAHTEDINACTLTTSPR。PQP信息可以来自于各类样本。当然最典型的就是该样本的DDA采集数据，所获取的信息有图1中的表格展示。从谱图库文件中的肽段定性结果出发，进行质控过滤后能提取到相对PQP信息。PQP包含了:对应的蛋白质，肽段序列，母离子m/z， 碎片m/z，母离子和碎片的电荷数，碎裂离子类型，预期的相对碎片离子强度和归一化的保留时间(一般我们用iRT，相对于一系列参考肽段矫正而来的归一化时间)。

整合了谱图库建立的各个步骤并可以提取PQP信息的工具包括：Skyline (Egertson et al， 2015)， PeakView (SCIEX)， Spectronaut X (Bruderer et al， 2015) (Biognosys) 和Trans-Proteomic Pipeline (TPP) (Deutsch et al， 2010)。还有一些工具可以预处理和转换[specL (Panse et al， 2015)， Fraggle/Tramler/Franklin (Teleman et al， 2017)] 或拓展[SwathXtend (Wu et al， 2016)] PQP信息库。MSPLIT-DIA工具可以用来优化和约束特别庞大的谱图库 (Wang et al， 2015)。

如果您需要进一步了解如何从DDA数据建立谱图库和PQP，您可以参考最近的一篇方法文章(Schubert et al， 2015a)（或者找我们了解SpectroNaut是如何快速建库的）。在接下来的章节中，我们将讨论建库用的信息类型和来源。

目前也有一类技术旨在不进行DDA数据采集而直接使用DIA数据，采用以谱图为中心的打分算法建库。当然这些方法尚处于起步发展阶段，最新的一些工具包括DIAUmpire (Tsou et al， 2015)， Group-DIA (Li et al， 2015)和Spectronaut X (Biognosys)，它们利用了目前最新仪器的卓越性能来改进DIA建库的固有缺陷。通常我们认为这些方法可以建立一套慢慢累积的谱图库，从而实现接近于不分级DDA数据的蛋白质组覆盖深度。

我们需要确定用内源的样本肽段，合成标肽还是用重组全长蛋白来建库 (图1)。目前SWATH-MS相关研究主要采用研究对象构建的DDA谱图库。这些库通常来自于检测对象的分级DDA分析数据，分级可以帮助提高建库结果的灵敏度 (Rosenberger et al， 2014; Zi et al， 2014; Selevsek et al， 2015)。这也是为何单针DDA分析的灵敏度和覆盖率一般都比SWATH-MS数据低的原因(Bruderer et al， 2015; Kelstrup et al， 2018)。因此，即使建库采用的是单针DDA谱图库，SWATH-MS数据也不可能覆盖整个数据库。反复进行单针DDA建库的策略有时候还挺受欢迎，当然主要因为是这个方法够简单；但是考虑到库的完整性和质量，我们还是应该考虑其他方法为佳。比如化学合成的标肽一直被认为是一个非常理想的先验知识的来源，尤其是在开发SRM方法的时候(Kuster et al， 2005; Picotti et al， 2010)，甚至于合成和检测某些器官的全蛋白质组肽段也有报道 (Picotti et al， 2013; Schubert et al， 2013; Kusebauch et al， 2016; Zolg et al， 2017)。这个方法有如下优势: (i) 不管是否曾被检测到，所有蛋白都在收集在库里，(ii) 由于合成标肽的含量可控、组成确定，所以能够得到非常高质量的MS2谱图及其相应的PQP信息，及 (iii)谱图库的假阳性率几乎为0。在某些情况下，到底选蛋白的哪条肽段去合成依赖于经验指导。当然，目前几乎某几个物种在DDA模式下能够得到完全的蛋白质组覆盖，每个蛋白的酶切肽依然依赖于理论预测(Mallick et al， 2007)。由于计算机预测的可靠性尚低于我们的预期 (Searle et al， 2015)，通过经验来选择肽段依然是必不可少的。最近的一些研究合成了蛋白质组规模的肽段(> 330，000人肽段)，其中还包含PTM和常见序列变异(www.proteometools.org; Zolg et al， 2017)。一种对这类策略比较有意义的衍生应用是用重组表达或转录组/翻译组系统的方法建立蛋白质全长序列。通过这种方法，每个蛋白最适合检测的肽段就能够通过经验找到(Stergachis et al， 2011; Matsumoto et al， 2017)。目前这些大规模合成肽段及蛋白的质谱数据还没有利用SWATH-MS分析，不过它们将是未来可利用的非常有用的资源。包含内源样品和合成标肽的混合库可以提高蛋白覆盖率，也是一种很有吸引能力的建库方法，目前已经在Mycobacterium tuberculosis这个物种的研究中得到利用 (Schubert et al， 2015b)。

以上讨论的一个常见推论就是到底是针对某个物种建立深度挖掘的DDA全库还是在每次研究的时候选择研究对象样本单独建库。这些库可以由样品本身或者合成蛋白质组来提供。现有的可供下载的器官水平的谱图库有S. pyogenes (Karlsson et al， 2012)， S. cerevisiae (Picotti et al， 2013; Selevsek et al， 2015)， M. tuberculosis (Schubert et al， 2013， 2015b)， H. sapiens (Rosenberger et al， 2014; Kusebauch et al， 2016; Zolg et al， 2017)， phyllosphere-colonizing bacteria (M. exotorquens， P. syringae 和S. melonis) (Muller et al， 2016) 和E. coli (Ludwig et al， in preparation)。当然，今后类似的可供公共下载的不同物种来源用于SWATH-MS分析的先验知识库肯定会越来越多(Craig et al， 2004; Martens et al， 2005; Deutsch et al， 2008; Picotti et al， 2008; Sharma et al， 2014; Whiteaker et al， 2014; Wilhelm et al， 2014; Zolg et al， 2017)。目前SWATHAtlas (www.swathatlas.org)网站致力于收集可用于SWATH-MS分析且兼容大多数分析软件的谱图库。目前使用这些公共资源的一个重要前提是它们能否在不同实验室和不同仪器类型间通用。已有研究评估了不同仪器上建立先验的DDA谱图知识库的异同 (Toprak et al， 2014)。尽管结论是最好在相同仪器平台上构建谱图库，但作者发现在肽段为中心分析算法的先验知识库构建中，不同仪器采用类似碎裂方式产生的碎片离子谱图具有相当的一致性 (比如 QqQ， QqTOF 和 Orbitrap HCD模式下的数据)(de Graaf et al， 2011; Zolg et al， 2017)。在利用了保留时间归一化(Norbeck et al， 2005)和进一步采用索引保留时间(iRT) (Escher et al， 2012)等算法后，不同实验室间的色谱数据也具有相当的可比性。这些方法的计算准确性在改变梯度时间和柱子长度后也是能够得到保证的；然而肽段的色谱流出顺序会受其他一些因素的显著改变，诸如流动相组成或柱温的改变，从而产生相当大的误差。最近一项跨全世界11个实验室的比较研究发现同一个器官的不同实验室来源谱图库可以有效的用于同一套SWATH-MS的分析(Collins et al， 2017)。另一个在大规模谱图库资源使用过程中需要额外关注的问题是海量样本、海量肽段数据的错误率控制。在这类分析中，如果数据库中某一分级中的先验肽段信息完全不存在与研究对象中（可检出水平），那么其相应的假阳性率会非常之高，这个影响在大量样本的研究中会产生累积效应。如果SWATH结果在蛋白水平整合评估，其错误率会受到以上因素的显著影响(Reiter et al， 2009; Rosenberger et al， 2017a)。因此蛋白水平的假阳性率需要比肽段水平的更加受到关注，而其假阳性率的计算也需要基于全局样品计算而不是每个样品单独计算。 Rosenberger et al (2017a)最近发表的研究建立了一种从发现式蛋白质组学中总结而来的统计方法，能够较好的控制SWATH-MS实验中肽段和蛋白水平的错误率。综上，采用基于器官特异性的现成数据库能够大大降低建库的工作量，但这样会因为海量数据的多重检验及矫正统计负担，导致丧失一定的统计学效能，换言之就是结果不一定尽如人意。折衷方法可以考虑并不直接检索谱图全库而是仅仅提取库中和研究对象或者相关生物学功能比较密切的一部分蛋白作为数据库。

在最初的SWATH-MS操作中，其主要目的是用来拓展SRM技术的检测范围的 (Gillet et al， 2012)。因此其首先是针对某一特定生物学问题相关的蛋白质来定量。但很快人们发现SWATH-MS可以利用谱图库提取复杂样品中大量肽段的离子色谱信息。随着时间推移，一次完整SWATH-MS研究可以获取肽段定量信息显著增长，在发展了合适的错误率控制算法后(Rosenberger et al， 2017a)，现在可以利用器官特异的谱图库及打分算法分析数十到十万条肽段，从而是该技术从服务于靶向蛋白质组演化成了发现式蛋白质组技术(Bruderer et al， 2017)。

到底是选择一系列感兴趣的目标蛋白还是全蛋白质组来分析取决于你的实验假设和目的，比如你检测到的这些蛋白质是否能够有效解释相关的生物学问题。如果一个生物学假设能够由一些选定的目标蛋白质的量变来解释，那么增加检测范围反而会给实验数据的统计带来额外的负担。而如果生物学假设无法用一小群特定蛋白的变化来解释的话，那么利用谱图库来检测尽可能多的肽段则可能为你提供足够丰富的结果信息，其带来的额外统计负担则可以忽略。

由于分子量、保留时间相似的污染肽段干扰，目标肽段的分析往往会受到假阳性信号的影响，这也是基于肽段中心的打分算法需要考虑的问题。比如序列高度相似的不同肽段、同一肽段发生修饰的分子量差异和肽段骨架上氨基酸分子量差异相同。最近一项基于DDA数据开放式修饰搜索的研究发现修饰对此的影像相对较小 (Kong et al， 2017)。开放式修饰搜索给出的非常见修饰肽相对于非修饰肽的比例也就大约1%。这也意味着修饰肽对SWATH-MS结果的假阳性率影像也微乎其微， 不过后续新算法的开发还是得关注下相似肽匹配的可能性(Rost et al， 2012)。目前的一些数据分析方法开发文献也开始考虑“peptidoforms”对SWATH数据的影像(Rosenberger et al， 2017b)。

综上，碎片离子数据的质谱、色谱高完整性优势使得DIA技术为多种数据分析需求提供了技术解决方案。其技术原理类似于SRM，因此也能够灵活地检测全蛋白质组或目标肽段。

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