DIA定量技术入门之四：如何进行一次SWATH-MS检测?

小编已连续在三篇微信推文中对DIA定量技术进行了详细的介绍，接下来，我们讲讲“如何进行一次SWATH-MS检测”。没有看到三篇软文的小伙伴，可以方便地通过下方链接查看：

DIA定量技术入门之一：DIA和SWATH-MS的“历史渊源”

DIA定量技术入门之二：SWATH-MS的“那些事”！

DIA定量技术入门之三：如何设计并建立SWATH-MS实验?

接下来，还有第五篇等着您！

SWATH-MS的液相色谱设置和常规靶向及DDA实验并无太大区别。一般采用0.5-2ug肽段混合物载入nano-HPLC系统，并用15–50厘米长的反相色谱柱(比如3或1.8um的C18填料)，在300 nl/min的流速下采用逐步增加有机相配比的方法洗脱。另外~5ul/min的microflow HPLC 系统也可以兼容SWATH-MS，就是灵敏度会损失3-5倍且需要进样3-5倍量的肽段样品 (Bruderer et al，2017; Vowinckel et al，2018)。

基于肽段中心分析SWATH-MS多窗口采集的方法依赖于采集足够多的数据点（典型值就是一个肽段10个点），来构建足够精确地色谱峰 (图2C)。现在SWATH-MS需要用2-4秒循环时间来覆盖整个母离子采集范围，同时每个谱峰需要采集到足够的数据点，因此平均色谱峰宽不能低于20-40秒。单窗口的DIA方法就截然不同，它只在单个MS1和MS2间进行采集循环，因此可以容纳2-3倍的高性能LC产生的色谱峰宽[比如AIF (Geiger et al，2010)或MSE (Silva et al，2006)]。随着质谱仪的扫描速度逐渐提升，更窄的色谱峰能够与多窗口SWATH-MS方法更好地兼容。另一个有趣的事情是SWAHT-MS能够很好地和短梯度HPLC兼容。DDA模式下梯度越短，采集到的MS2谱图及鉴定到的肽段随之成比例下降，而SWATH-MS中MS2采集在较短的梯度下并不会造成肽段鉴定的大量损失(图2A)。SWATH-MS模式下缩短梯度而导致的肽段数目变少可能是和母离子共流出增多及同时发生的离子信号抑制和共碎裂效应，而不是来不及采样。当然随着质谱仪器性能进一步的提升，SWATH-MS必将在较短的梯度实现更好的选择性和鉴定率，从而实现更高的检测通量。

综上，我们建议采用2小时nano-HPLC梯度来采集高质量的谱图库(Schubert et al，2015a)，同时为了实现更高通量，SWATH-MS采集的时候也可以考虑缩短梯度到比如30-60分钟，其选择性和蛋白质组覆盖度也不会降低的太多。

SWATH-MS采集过程最优化的母离子(MS1) 和碎片离子(MS2)扫描参数取决于一系列因素，如分析对象预期的分子量范围，样品复杂度，质谱仪器本身的分辨率和扫描速度，LC设置及其色谱峰宽，还有就是你预期的灵敏度和选择性。实践中我们需要关注的参数如下：(i)需要覆盖的母离子m/z范围，(ii)母离子隔离窗口的宽度，(iii)碎片和母离子累积/扫描时间和分辨率，(iv) 色谱循环时间和(v)每个样品注入量。在以下章节中，我们将详细讨论每个参数的影响。本文作者在Q-TOF类型仪器上的经验比较丰富，所以我们的建议都基于各自的使用、优化和仿真经验(Rost et al，2012)。不过，随着Orbitrap仪器目前在SWATH-MS分析中越来越常用，我们同样会提及该平台上成功使用并发表的相关文献。采集窗口的详细举例参见表格EV1，包括Q-TOF和Q-Orbitrap仪器。这些参数可以作为你产出高质量SWATH-MS数据的一个起点;当然后续基于此的优化肯定可以得到更多的可定量蛋白质和肽段。需要最后指出的是，Q-TOF和Q-Orbitrap仪器上SWATH-MS的采集参数以后肯定还有很大的优化空间。

覆盖的母离子m/z范围

SWATH-MS检测覆盖的母离子m/z范围取决于一系列母离子隔离窗口合并后覆盖的区域。理想情况下，质量范围当然是尽可能的覆盖所有肽段出峰的m/z。检测对象如果落在范围外自然是没法检测及定量的。所以如果你的目的是检测蛋白质组中尽可能多的部分并且采用了胰酶酶切，那么肽段最丰富的m/z范围是400–1，200 m/z (Gillet et al 2012)。在部分仪器上，该范围也可以缩小到500–900 m/z (Egertson et al，2015) ，同时不会损失太多定量蛋白。如果你用了其他酶或者并不是分析肽段（比如代谢物），那么母离子覆盖范围自然得相应调整。

母离子隔离窗口设置

母离子隔离窗口定义了每个MS2扫描所共采集和共碎裂的母离子质量范围。因此，隔离窗口宽度直接影响了选择性和检测的动态范围。该参数应该也是在不同实践方法中区别最大的，从800 m/z一个窗口到数百个2m/z窗口不等。

虽然较宽的隔离窗口能够让质谱仪循环扫描的更快，但同时也会共碎裂更多的肽段母离子，从而导致MS2变得更加卷积，以及灵敏度也随之变低。相反的，较窄的隔离窗口能够得到较少的共碎裂母离子和信号干扰，但其他参数比如能够覆盖的母离子范围或每个色谱峰采集到的数据点可能就不够了。

有一点需要注意的是每个母离子隔离窗口的大小都是可以单独设置的。采用可变窗口能够获得更好的鉴定数或者母离子在各个窗口中的强度分布会更均匀(Zhang et al，2015)(图2B)。这种优化可变窗口的方式可以在每个样品或者同一个实验多个样品中分别设置。目前也有了一些基于经验数据的自动设置窗口软件(比如SCIEX的“SWATH Variable Window Calculator”)。经过实践发现，优化窗口宽度并不会显著影响肽段数量或者定量结果。为了证明这一论断，我们在TOF仪器上采用了一套“通用的64个可变窗口”（表EV1）的采集方式，结果发现其可以通用的分析复杂性从人器官到细菌等不同的样品。这种母离子隔离策略可以从人细胞系中提取到约50000个酶切母离子信号，从5.9 m/z宽度[472.4–478.3]范围的最高密度信号窗口，到90.9 m/z宽度[1，109.6–1，200.5]范围的低密度信号窗口。从原来的32个固定窗口到64个可变窗口，我们发现定性和定量上都得到了提升(Navarro et al，2016)。Bruderer et al在Q-Exactive 优化得到19可变窗口设置(Bruderer et al，2015) ，而在Q-Exactive HF上设为24个可变窗口(Bruderer et al，2017)。Kelstrup et al(Kelstrup et al，2018)发表了Q-Exactive HF-X上用的72个可变窗口方法 (表EV1)。

最近，一些新的DIA采集方法也使用了一些不太一样隔离窗口设置 (Egertson et al，2013;Moseley et al，2018)。肽段隔离过程中不同的干扰因素在这些方法中起到的左右又各自不同，因此都需要特殊的去卷积工具进行去卷积、后处理。

碎片和母离子累积时间和解离能量

对于Q-TOF仪器来说，质谱采集或累积时间决定了质谱仪对某个特定MS扫描能够积攒多少离子信号。累积时间越长，则信噪比越好。但是，较长的累积时间将影响质谱的循环采集时间。因此，累积时间必须和母离子隔离窗口的大小相适配(图2C)。对于Orbitrap质谱来说，质谱采集时间分为两个平行的时间相隔过程。首先，“注入时间”用来收集离子阱中有自动获取控制（AGC）参数控制的所需数量的离子。其次，“扫描时间”是Orbitrap所需近路质谱谱峰的时间，其取决于分辨率。在新一代Orbitrap质谱上(Q-Exactive系列以及Fusion/Lumos)，这两个过程是平行进行的，因此更耗时的那一步决定了循环时间。典型的最大离子注入时间由所需的扫描时间来确定。近期的相关文献报告采用19个(Bruderer et al，2015)(Q-Exactive)和24个可变窗口(Bruderer et al，2017) (Q-Exactive HF) ，分辨率30000 (Full Width Half Maximum) 或者70个窗口(Kelstrup et al，2018) (Q-Exactive HF-X) 固定9m/z窗口，分辨率15000 (表 EV1)。随着仪器性能的快速提升，将来一定会有更优化的参数。

综上，Q-TOF质谱联用nano-LC 系统，平均色谱峰宽约30秒，采用64个可变窗口的时候，我们建议MS2累积时间约50毫秒。其完整循环时间约为3.3秒。而Q-Exactive HF采用30000分辨率，24个可变窗口 (Bruderer et al，2017)，可以得到相似的循环时间。当然，由于加入了AGC，扫描时间和工作周期这些影响因素，Orbitrap仪器需要进一步单独优化。我们还建议在Q-TOF仪器的每个循环MS2扫描前加入一个250毫秒的MS1扫描。Orbitrap仪器同样建议加入一个或数个MS1扫描。来自于MS1的信息可以在一些最新的DIA分析软件中得到充分利用，比如用来辅助确定肽段的母离子分子量或者辅助共流出碎片离子的去卷积。

色谱循环时间

在SWATH-MS中，“循环时间cycle time”，或叫“工作周期duty cycle”或者“采样率sampling rate”对应的是MS1和MS2扫描的累积时间总和(及加上仪器内部开销时间，可忽略)。因此，循环时间定义了肽段的同一个离子在色谱流出时如何被采集的。循环时间对任何基于色谱信号定量的方法都是至关重要的。一般来说，构建色谱谱峰峰型需要10个采样数据点来进行精确定量 (图2C) (Matthews & Hayes，1976; Lange et al，2008)。不过采集到10个数据点的平均色谱峰宽各自不同，其取决于色谱设置。在一个平均峰宽（基线处）大约为30秒左右(3 um C18填料的nano-HPLC，梯度时间1-2小时的典型值)的实验中，循环时间设为3秒比较合适。当然，如果你使用了一个更高分辨率的色谱系统，平均肽段流出峰宽可能会窄到5秒的话，循环时间可以较少到0.5秒(图2D)。

每个样品的注入次数

对于数百个样品规模的蛋白质组学研究来说，单针进样是保证通量和定量一致性的最佳选择。不过小规模实验的话，每个样品多针进样（N），每针覆盖不同的m/z范围则是一个挺有吸引力的用以增加选择和灵敏度的替代方案(Panchaud et al，2009; Ting et al，2017)。这样可以缩小母离子隔离窗口宽度N倍，总而保证覆盖一个较大的母离子m/z范围。（译者注：Spectronaut也支持分级DIA数据分析）

在DDA，SRM和PRM采集方式中，碰撞能力可以对母离子进行设置(基于母离子m/z和电荷数)，或者更可以针对特定的transition设置 (SRM)，然而在SWATH-MS中只能对每个隔离窗口设置碰撞能量。换句话说，如果两个肽段有不同的电荷数且位于同一个隔离窗口内，他们会在相同碰撞能量下共碎裂，这样看着似乎不那么合适。不过这样欠妥的肽段碎裂在某种程度上由谱图库的信息来弥补。可以在谱图库中提取DDA碎片离子，并转换成电荷数无关的碰撞能量公式，比如碰撞能量随母离子m/z而变化但和电荷数无关。需要注意的是这个策略会导致DDA分析结果在高电荷数肽段的鉴定数量下降。这种损失也可以部分通过在一个SWATH窗口中斜升碰撞能量来弥补，比如同时在DDA和SWATH模式MS2累积时间中，从-15渐进到+15 V。

综上，在Q-TOF仪器中，我们建议在DDA谱图库构建时，碰撞能量的设置和m/z为2电荷的母离子成比例，并且在SWATH-MS中，在隔离窗口中心的理论2电荷母离子也设为相同能量。我们还建议系统性的评估不同仪器及公共数据库的碎片相似度。目前也有软件支持这样的比较分析(Toprak et al，2014)。如果发现样品谱图库和SWATH采集的碎裂模式差异较大，我们建议最好优化碰撞能量以达到最大的碎裂相似度。这样能够保证不同肽段的匹配参数在不同仪器和实验室间能轻松对接。

图3 采用轻微重叠的母离子隔离窗口的原理解释。

(A) 在早期SWATH-MS方法优化中，相邻的SWATH窗口会有1 m/z的重叠以避免四级杆选择离子时在隔离窗口边缘产生的传输效率损失问题 (B) 为了降低母离子同位素被相邻窗口隔开的效应(C and D)。(B)图解离子传输效率在四级杆质谱中以 [500–526] m/z范围为例的衰减情况。(C) 二电荷肽段MLSYPITIGSLLHK (m/z = 524.965)理论同位素分布。如果不采用窗口重叠的话，[(500–525)和(525–550)]间的同位素信号会大幅衰减且被分隔。就算窗口边缘没有母离子(比如525.1)，离子衰减依然存在，同位素分布信号也会失真。(D) 在窗口重叠的情况下[(499–525)和(524–550)]，大多数母离子同位素都会被有效传输[如(499.5–524.5) 和(524.5–549.5)]。

在最初的SWATH-MS文章中，我们建议相邻的SWATH窗口有1m/z的母离子隔离窗口重叠(图3A和表EV1) (Gillet et al，2012)。这么做有两个理由：第一，四级杆中的母离子传输在整个隔离窗口分子量范围内不都是100%的效率，而在边缘处会减低(图3B)。因此，一个微小的窗口边缘重叠会补偿这样的损失。第二，重叠窗口保证了母离子同位素峰的最大完整性，避免了母离子在窗口边缘被分割后无法重构完整的同位素分布的问题(比较下图3C 和D)。重要的是，除非整个母离子同位素分布被隔离，碎片离子都会因此而受干扰，从而使得其数据匹配打分降低(见后续章节“自动谱峰分组打分”)。至今为止的SWATH-MS相关采用1m/z重叠窗口的文献也不都是因为以上如此极端的原因而这么做的，同样的，更大一些的隔离窗口重叠在将来也是值得考虑的策略。就算母离子同位素分布在两个相邻窗口间会被分隔(见图3C)，该肽段的非标定量差异值在不同样品检测的时候也是正确的，只要你设置的窗口保持不变(Egertson et al，2015)。当然，如果你在类似的实验中采用SILAC类型的实验设计从而导致轻重离子对可能其中之一被分隔在两个窗口内，那么轻重离子比值可能会有失真。另一个可能降低该效应的方法是将隔离窗口的质量边缘设置为极少可能出现肽段的数值Egertson et al (2013)。这些理论上最优的窗口设置可以通过Skyline软件轻松设置(Egertson et al，2015)。尽管这样做这样并不能解决窗口边缘的信号损失问题，也不能防止母离子分隔在不同窗口，它可以保证单同位素峰不会正好落在窗口边缘。

综上，Gillet et al(2012) 提出的1 m/z重叠窗口的方法因为检测窗口被略微放大，会略微降低选择性。但它带来的好处是巨大的，可以将肽段信号在隔离窗口边缘的损失效应降低，得到更完整的同位素峰分布。当然，如果你不想用这个方法，那就最好用Egertson et al (2013)提出的优化窗口设置的方法了。

图4. 改善母离子选择性的一些新DIA采集方式。

(A) Multiplexed DIA (MSX) (Egertson et al, 2013) 通过设置非连续的母离子窗口来改善选择性。(B) 在offset-windowed DIA方法中，母离子隔离窗口边界在连续扫描间加入一个偏移量，比如25 m/z的隔离窗口在每次循环间边界进行12.5m/z的偏移。(C)“scanning quadrupole”隔离方法，也称之为SONAR (Moseley et al, 2018)，质谱仪连续无级扫描整个感兴趣的母离子分子量范围，比如500到900 m/z，使用200 × 20 m/z宽的窗口，2 m/z增量扫描。

SWATH-MS的选择性是由母离子隔离窗口宽度直接决定的。而选择性则直接影响了最终达到的动态范围和SWATH-MS检测能实现的灵敏度。最近也有一些更新的SWATH-MS检测技术能够改善选择性(图4)。

Multiplexed DIA (MSX)

2013年，MacCoss课题组报道了MSX技术(Egertson et al，2013)，一种多通道DIA方法。不像SWATH方法采用20m/z宽度来选择母离子，MSX采用每个循环中非连续的采集不同的隔离窗口的方式(比如5个非连续的4m/z宽的隔离窗口图4A)。在MSX方法中，每张谱图总的绝对选择性和SWATH-MS的20 m/z是一样的。然而在MSX中，一个特定肽段母离子会在每个循环中被随机共碎裂到不同离子群中，使得其受到的检测干扰在流出过程中各不相同。在其最新的改进方法中，MSX需要质谱仪器能够多通道的诱捕离子能力（这样排除了Q-TOF类仪器）

隔离窗口偏移技术

在隔离窗口偏移技术中，母离子的隔离窗口边界在连续循环间被反复正向和反向大幅偏移 (比如25 m/z的隔离窗口，偏移量12.5 m/z; 图4B)。和MSX类似，偏移采集技术产生了不一样的母离子隔离和共碎裂谱图。因此，来自同一群离子的共碎裂干扰可以通过该方法来进行计算消除。该方法改进了选择性并降低了定量限制，且并不需要额外牺牲循环时间、累积时间和分子量覆盖范围或分辨率。(https://skyline.gs.washington.edu/labkey/files/home/software/Skyline/2013-ASMS-Overlapped-DIA.pdf)。但是，该方法需要在数据去卷积前先用自动解析算法来预检原始数据或者原始碎片离子的提取。不像MSX，该方法也可以在非离子阱类仪器如Q-TOF上使用。

Scanning quadrupole isolation

最近的一个SWATH-MS的新技术叫做“SONAR” (Waters) ，由Moseley et al (2018)开发。 不再进行渐进式的隔离窗口循环扫描，该技术中四级杆会进行无级“scans”，比如，以24m/z宽度的隔离窗口在整个感兴趣的母离子质量范围内无级循环扫描 (图4C)。换句话说，在传统SWATH-MS方法中，某个特定的母离子只会出现在一个隔离窗口中，而在 “scanning windows”中，我们可以看到随着母离子同位素反复进入和离开扫描窗口而产生的碎片离子信号的出现和消失。这就在SWATH-MS数据中所包含的保留时间，质量数和强度维度外又增加了第四种维度。该方法需要大量改动已有的数据分析工具，但额外增加的第四维度信息同样可以增加数据的选择性。

图5. SWATH-MS数据基于肽段中心打分算法的原理

(A) 肽段中心打分算法首先需要一系列肽段查询参数（PQP），包括目标肽的保留时间，母离子质量数，碎片离子质量数和碎片离子强度信息（红色表格）。Decoy肽段的PQP信息在分析时同样也需要对应产生，比如反转目标肽段的氨基酸序列同时保持末端氨基酸不变（蓝色表格）。Decoy肽段被用于评估肽段的定性结果是否是随机匹配的可能性。(B) 目标肽段和Decoy肽段在SWATH-MS2谱图中连续采集构成的PQP生成的提取离子流图(XICs)。这使得经过转换和精简的数据结构和靶向蛋白质组（SRM或PRM）很相似。(C) 碎片离子色谱图是根据其对应的肽段关联性进行组合，并选定有确定保留时间范围的 “peak groups谱峰组”。(D)同时针对目标和decoy谱峰计算基于色谱和质谱峰信息的得分分布，并基于半监督学习算法组合成判别得分（Discriminant score）。一系列检测到的肽段的错误发现率(FDR)可以通过目标和decoy肽段的得分分布进行统计建模来评估。(E)对于大规模SWATH-MS分析，错误比例的控制不仅仅需要针对肽段水平，更需要扩展到蛋白水平进行评估。进一步来说，大规模实验包含了大量的样品，每个单独样品进行错误比例控制并不足够严谨，最好在“整个实验规模”的进行控制。“全局”环境考虑的是基于所有样品的检测到的谱峰组，肽段或者组合的蛋白。(F)在多个样品间利用色谱时间一致性进行谱峰对齐并在样品间转移定性结果可以帮助矫正或增强谱峰检测的可信度。

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