DIA定量技术入门之五：数据分析算法介绍

今天小编为大家带来DIA定量技术入门之五：SWATH-MS数据的打分策略。没有看到其他四篇微信的小伙伴，点击下方链接了解更多DIA定量技术：

DIA定量技术入门之一：DIA和SWATH-MS的“历史渊源”

DIA定量技术入门之二：SWATH-MS的“那些事”！

DIA定量技术入门之三：如何设计并建立SWATH-MS实验?

DIA定量技术入门之四：如何进行一次SWATH-MS检测?

过去20年出现过多种多样的DIA数据分析策略。这些策略总的来说可以分为两大类，基于谱峰为中心或基于肽段为中心的数据查询方法(Ting et al，2015)。本教程我们重点关注依赖色谱信息的肽段为中心的分析流程，我们将在下面着重讨论其每步算法并在图5插图说明。对于其他分析策略，可以参考以下综述(Chapman et al，2014; Bilbao et al，2015)。已有不少软件包含图5中的绝大多数分析步骤。比如有OpenSWATH (Rost et al，2014) (OpenMS的组件，Rost et al，2016b; Sturm et al，2008)，Skyline (MacLean et al，2010)，PeakView (SCIEX) 和Spectronaut (Bruderer et al，2015) (Biognosys)。最近也有文章专门用一套实际数据对以上这些肽段中心算法软件以及谱图中心算法软件DIAUmpire(Tsou et al，2015)进行了对比(Navarro et al，2016)，并且发现它们之间的定性、定量一致性还是非常好的。（译者注，其中表现最佳的是Spectronaut）。

肽段中心分析的第一步工作就是要定义PQP。最近一些新算法可以不依赖于凭经验获取的PQP (Tsou et al，2015; Ting et al，2017)，因此可以不再使用构建先验知识的谱图库了，由实验数据里的碎片离子谱峰构建的PQP同样可以提供较高的灵敏度，尤其是采用较大的母离子隔离窗口（>5 m/z）的时候。取决于样品的复杂性，一般都能给每个肽段找到多个高质量的谱峰组（peak group）。我们采用和目标肽性质，如色谱和质谱参数空间类似但不会存在于样品中的decoy肽段来定量描述这些谱峰组的出现频率。Decoy PQP由目标肽段氨基酸序列反转或随机组合模拟而来(图5A)。因为Decoy肽段可以用于评估共流出的色谱峰质谱碎片离子的随机效应，对于控制SWATH-MS数据中肽段检测和蛋白组装的错误比例来说至关重要(Rost et al，2014)。由于在肽段匹配时采用6个共流出碎片离子和采用3个共流出碎片离子的得分分布并不同，我们建议对目标肽段和decoy肽段进行谱峰打分时采用相同的碎片离子来避免打分偏差。

肽段中心数据分析策略的下一步就是采用定义的PQP来提取目标肽段的母离子及碎片离子的色谱峰信息。随着肽段从色谱柱流出，它对应的碎片离子强度会随之按照高斯分布的肽段流出曲线同步变化，从而构成“peak group谱峰组”的色谱峰用于评估肽段检测结果及其定量值(图5B)。目标肽和decoy肽段是采用相同的方式来提取碎片离子色谱峰的。实际上这步提取步骤转换并精简了SWATH-MS2谱图，并使之非常近似于SRM或PRM数据。为了充分改进肽段中心的SWATH-MS数据分析的选择性，色谱峰提取不会在整个色谱梯度上提取而是会基于目标肽的预期流出时间附近的保留时间窗口中进行（和scheduled SRM方法类似）。为了尽可能调整和预先构建的谱图的流出时间变形及限制保留时间提取窗口的大小，我们会采用检测一系列内源性(Parker et al，2015b; Bruderer et al，2016) 或掺入合成的肽段(Escher et al，2012)。这些参考肽的特征流出时间作为锚点来进行保留时间归一化(例如iRT方法; Escher et al，2012) ，然后样品中的肽段保留时间可以据此对齐。自动采用归一化的索引保留时间对齐功能在各类SWATH-MS数据分析软件中都已采用 (比如 OpenSWATH，Skyline，Peak-View和Spectronaut)。质量容差或提取离子峰宽也同样直接影响了色谱峰信号的选择性和获取的定性结果打分及定量计算准确性。一般来说，提取峰宽是质谱峰的半峰宽的话能够在最大化离子信号获取和保证可靠地选择性间获得一个很好地平衡。实际上，我们建议在MS2分辨率为15000的时候采用提取峰宽约50ppm或更低。

MS2数据保存为profile或者centroid都可以进行色谱峰提取。Centroid的MS2数据文件明显小于profile，而且分析结果定性数量和定量准确性上和profile几乎没有区别(Navarro et al，2016)。Centroid数据的提取窗口宽度可能没法像同一个数据profile模式优化的那么好，因为profile的谱峰可以进一步进行质量数错误矫正。不过数据centroid算法对数据分析影响很大。我们发现这对质量精度、信噪比和相对碎片离子强度影响很大(比如，centroid是如何处理峰高和峰面积的) (Toprak et al，2014)。由于肽段共碎裂谱峰的高度复杂性和高度互相交盖，SWATH-MS数据的centroid难度依然很高。这种和算法相关的人为影响会导致碎片离子谱峰组打分和肽段检测的统计结果。因此我们建议遵从仪器厂商和算法开发者的建议来选择合适的centroid算法。

最后，如果SWATH-MS数据在循环时间内也采集了MS1数据，母离子的离子流也能够提取并打分计入碎片离子谱峰组结果，用以提高肽段鉴定置信度。

在数据分析流程的下一个步骤里，一个或多个潜在的色谱谱峰组的左右边界由专门算法来定义，并对每个候选的肽段包括目标（target）序列和decoy序列单独进行打分(图5C)。在打分过程中计算得到一系列不同的独立得分 (Reiter et al，2011)。然后被分组为五个类别：(i) 得分和色谱表现相关，(ii) 得分反映了检测到数据和谱图库的相关性，(iii) 得分反应数据和外源或内源的同位素标肽(如果有)，(iv) 得分考虑MS2谱图的高分辨及高精度质量信息和 (v) 得分来自于挖掘母离子（MS1）中蕴藏的信息。以上所有或大多数互相独立的打分或多或少的都会被以下软件所整合：OpenSWATH，Skyline，PeakView 和Spectronaut，并且会将它们组成成一个单一的最终判别打分。

通过采用对SWATH-MS数据的提取离子色谱信息进行上节所说的独立打分，便能计算这些得分的分布。理想情况下，这些得分的“真阳性”和“假阳性”分布会清晰地分隔开。然后，有些得分可能因为实验相关的一些因素如样品复杂度，仪器表现和SWATH-MS参数设置等原因比其他一些得分更高，但单一得分并不足以判断肽段定性和定量结果的准确性。因此，将多种独立打分结果混合成一个单一的判别分数可以对肽段定性实现尽可能高的灵敏度（图5D）。我们可以用半监督学习算法来实现这一目的(Kall et al，2007)，其采用循环逼近的策略得到独立得分间最优化的权重分配组合实现充分的分离target和decoy结果。我们通常认为判别得分最高的谱峰组（第一名，图5C）是最可能检测到的匹配肽段，并最终通过跨样品的结果比对来确认其准确性。SWATH-MS数据的成功学习和统计建模依赖于几个因素。首先半监督算法获得真实检测结果的得分特征并实现合理独立打分权重组合依赖于获取足够数量的高得分真阳性肽段。其次，decoy肽段序列必须合理的代表那些无法在此样品中检测到的肽段。综上，我们强烈建议分析完SWATH-MS工具中相关报告的target和decoy得分分布，并确认(i) 基于decoy得分分布得到的假设并无错误（比如正态性），(ii) target得分分布在分析复杂样品且谱图库相对规模较大时应该接近于双峰分布，(iii)decoy 分布的顶端，形状和宽度与target双峰分布中的真阴性部分匹配(图5D)。在某些情况下，谱图库如果和样品中检测到的母离子高度一致(> 90%)，target分布的真阴性部分可能会非常小，从而导致要点(iii)难以判断(Reiter et al，2011)。如果有一个或更多要点无法满足，那么机器学习或q-value评估这一步可能就会失败或者产生偏差，从而导致统计结果失真及不合理的错误比例控制。

上文描述的分析策略通常应用于单个样品检测。然后在某些情况下这样做会引入偏差，尤其是样品肽段数量巨大的同时分析对象数据集里包含了大量的异质样品或背景数据库里有大量的不同类型来源的样品信息(比如来自于公共数据库) 以及库里有可能包含大量对于检测样品来说的真阴性肽段和蛋白质。因此，我们建议根据特定数据的需求来设计分析策略，具体可以参考Rosenberger et al (2017a)。简略地说，为了保证整个数据集各个样品间的打分和统计结果的可比性，半监督的机器学习步骤需要在所有样品、所有候选谱峰组结果以整个实验为单位进行计算(图5E)。就优化实际体验来说(文件大小和内存限制)，这步也可以考虑采用每个样品随机采用小部分肽段匹配结果进行统计评估来代表整个数据集的结果(Rosenberger et al，2017a)。1% 肽段FDR的阈值用于过滤每个单独的样品(参考图5E “run-specific” context)可能对小样本数据及样品专属的谱图库是足够有效地，但是在处理大规模样本的海量匹配结果时，假阳性可能就会累积。和DDA数据库搜库策略相似，大规模数据集上采用更严格的如多重假设检验的打分过滤策略是必要的。我们因此建议不仅仅在肽段水平，蛋白水平也要进行target decoy的假阳性评估(Rosenberger et al，2017a)。还有最好是采用基于“整个实验样品水平上”FDR评估，采用单一得分分布的q-value值，并且基于“global”策略，对所有样品的同一个谱峰只选取最佳匹配结果的肽段及蛋白组装信息。我们建议为了防止大样本量实验的假阳性率累积，最好采用全局蛋白及肽段的1%FDR控制(图5E; Rosenberger et al，2017a)。以上描述的基于特定背景的错误率控制方法目前在OpenSWATH的组件PyProphet(Rosenberger et al，2017a)，和Spectronaut (Bruderer et al，2017)均能使用。

基于肽段中心打分算法的一个主要假设就是每个肽段只有最高得分的谱峰组能够反映其真实信号。实际上并不总是如此理想，比如当多肽丰度在一个或多个样本队列中下降到检测限以下时，非来源于目标肽的候选峰组得分较高。这个错的谱峰组检测和真正的肽保留时间不同,导致在最终的肽量化矩阵中出现一个错误值是经常发生的。通过再分析跨样本和保留时间的一致性以及用最可靠鉴定结果的样品来对齐谱峰组的峰边界,就可以检测并修改假谱峰组产生的排名错误(图5F)。该处理方式有时候可以重排谱峰组结果或挽回一些被1%肽段FDR过滤去除但其实落在预期保留时间内的结果。现有的多样品保留时间对齐的算法比如TRIC (TRansfer of Identification Confidence)，目前是OpenSWATH的分析流程中的一部分(Rost et al，2016a)。

综上，多样品对齐方法和目前已经成功应用在DDA数据中国的相应分析方法类似(Prakash et al，2006; Mueller et al，2007; Cox et al，2014)。不过，DDA肽段定性和定量结果是基于保留时间和母离子m/z进行对齐而SWATH-MS会采用所有碎片离子作为对齐参考信息并控制错误率。

和其他自下而上的LC-MS/MS蛋白质组工具类似，SWATH-MS的定量信息是来自于肽段，通过多个碎片离子的峰面积进行加和或者平均得出。当然不是非得用肽段所有的碎片离子计算才能精确定量。最好选择高质量和信号没被干扰的碎片进行定量，当然目前全自动的分析算法已经开发成功(Keller et al，2015; Teleman et al，2015)。另外，基于母离子提取离子流的MS1定量方式可以提供正交的定量信息(Rardin et al，2015)。然后，在很多情况下，母离子定量方法在临近定量灵敏度下限(LLOQ)时，会比基于碎片离子定量的方法更不准确(Gillet et al，2012; Egertson et al，2013; Collins et al，2017)。这是因为MS1全扫描相对于MS2隔离窗口检测的选择性更低。为了从SWATH-MS中推导蛋白质的丰度，一个或多个肽段检测到的信号强度需要合计为最终每个样品中的蛋白质信号强度。为了实现该目标而开发了多种分析策略，比如：(i)每个蛋白质取其中最强信号的n个肽段进行加和或平均(Silva et al，2006; Ludwig et al，2012)，(ii) 将所有肽段信号强度进行加和而不管其是否在每个样品都能检测到 (iBAQ; Schwanhausser et al，2011)，或(iii)只考虑在比较的各个组别中均能检测到的肽段用于蛋白质的定量(LFQ; Cox et al，2014)。这些加和的蛋白质强度值可以根据需要进行归一化来反应各个蛋白的可检测性，比如根据蛋白长度(Zybailov et al，2006)，理论肽段数(Schwanhausser et al，2011) 或计算得到的肽段检出可能性(Lu et al，2007)。缺失值可以通过多样品间的对齐分析(Rost et al，2016a) 或者统计算法插值来填补(Karpievitch et al，2012)。和通常仅仅检测一小部分目标蛋白的代表肽段来定量的SRM或PRM技术相比，以及大规模样品中每个蛋白能定量到的肽段不一定相同的DDA技术相比，SWATH-MS基于肽段中心的分析提供了一个更加一致且完整肽段定量信息用以蛋白质定量。在不同实验分组间通过计算碎片离子强度差异从而计算差异蛋白或肽段的统计工具目前也已有发展(Chang et al，2012)。为了让蛋白定量比较的一致性达到最高，我们建议系统性的采用SWATH-MS数据中每个蛋白质最稳健的碎片和肽段统一比较。为了选出这些碎片和肽段，我们需要获取每个肽段的碎片离子相对信号强度和每个蛋白的肽段相对强度信息并用于整个数据集，比如MSstats (Choi et al，2014) 或mapDIA (Teo et al，2015) 这两个用于统计倍数差异的工具。

基于肽段中心打分的SWATH-MS基于当然也可以和翻译后修饰（PTM）肽段的定量检测兼容。然而，SWATH-MS数据分析修饰肽段也有其难点，主要是MS2谱图中可能包含高度相似的相关肽段影响检测，比如非修饰肽段，骨架相同、修饰相同而修饰位点不同的肽段或者骨架相同而携带相同或相似的同位素修饰。这些肽段可能在同一个SWATH-MS隔离窗口并产生多个高得分的谱峰组。

和DDA分析一样，也有人开发了专门分析DIA和SWATH-MS数据中修饰肽的策略。其中最直接的方法就是建立修饰肽的PQP，比如从富集了修饰肽段建立的DDA谱图库中提取相应信息或者采用开放式修饰搜索策略(Na & Paek，2015)。有另一种分析策略依赖于用非修饰肽段的PQP去匹配修饰肽段并重点关注除了最高得分外的其余高得分谱峰组。那些额外的谱峰组有可能是和非修饰肽位于同一个或不同的隔离窗口内。此类策略目前被整合入MSPLIT-DIA (Wang et al，2015)和SWATHProphetPTM (Keller et al，2016) 并被发现当谱图与能决定修饰位点的碎片足够相似时就能成功分析(Toprak et al，2014)。最近另一个叫做“Inference of Peptido-Forms” (IPF) (Rosenberger et al，2017b)的算法将标准的Open-SWATH分析流程拓展到了修饰肽。IPF采用两步分析流程，第一步和标准的OpenSWATH流程很像，从DDA或DIA采集的谱图库中提取最高质量谱峰组的6个碎片离子并对其进行打分。这些transition需要和目标肽段序列匹配及修饰类型、数量所匹配，不过它们不需要精确匹配位点。在第二步中，IPF提取MS1中的母离子和理论预测的可以区分修饰位点的碎片离子XIC。这些信息用贝叶斯分层模型整合入一个单一的肽段构型置信度得分，并给每个检测到的谱峰组打分。而位点置信度据此进行重新评估，即使其并不存在于谱图库中。

综上，PTM-SWATH分析可以用于分析全细胞裂解液也可以用于特定类型修饰的富集样品，比如磷酸化富集样品。近年来，已有多个修饰类型被成功进行SWATH-MS分析 (Krautkramer et al，2015; Sidoli et al，2015; Lawrence et al，2016; Rosenberger et al，2017b)。尤其是包含大量不同状态或样品重复的实验，我们也可以将类似的定性迁移和定量分析策略用于分析修饰和非修饰肽段。