iST试剂盒处理微量样品，方法及结果比较

今天我们从样品制备上着手，介绍基于iST技术路线的微量样品处理结果比较。本文用最常规的方法，无须额外硬件，介绍10000个细胞的处理流程。和很多文献100个、500个、1000个细胞相比，我们的主要特点是对人的手艺要求，实验室的软硬件要求都很常规，可重复、成本可控。我们目前也实现了100个细胞，在老一代质谱上定性约1500个蛋白的结果，不过由于无法用试剂盒直接操作，并非无缝对接常规实验流程，故不在此展开。

背景技术参考资料

• Mann的首选，PreOmics iST与Spectronaut强强联手打造DIA最佳上下游方案
  

• 如何做:好的蛋白质组学？202012update
  

与常规路线相比，见下图，iST的处理步骤比常规方法少，样品转移次数少，损失小同时处理时间短得多。除了IST试剂盒，无须其他额外设备。

那么结果如何呢？

细胞测试

选用LM3肝癌细胞，10000~200000个进行对比

实验步骤

常规步骤

1. 取出样本，加入50μl尿素裂解液（8M尿素），涡旋混匀（加入裂解液的体积与细胞数量有关，可适当调整）；

2. 冰上裂解30min，期间每隔10min涡旋混匀一次；

3. 4℃、12000g离心20min，取上清；

4. 上清中加入适量DTT（终浓度10mM）溶液；

5. 37℃、600rpm孵育60min；

6. 还原结束后待样品恢复至室温，加入适量碘乙酰胺（终浓度40mM），室温避光孵育40min；

7. 还原烷基化结束后将样品稀释，使尿素浓度小于1M，然后按比例加入适量胰酶（1:50），37℃、600rpm过夜酶解；

8. 酶解结束后stagtip进行除盐，抽干后LC-LOAD复溶（1-4 10ul复溶，5-6 20ul复溶）；

9. 质谱上机（5ul）。

iST步骤(以下步骤1-10均可用PreON自动化完成）

1. 每个细胞沉淀中加入 50μl LYSE 试剂，涡旋混匀后 95℃，1000rpm 加热 10min；

2. 使用试剂盒配置的 ADAPTER 将 CARTRIDGE 安装在 WASTE 管上，并做好标记；

3. 将加热后的蛋白样品冷却至室温，瞬时离心后转移至连接好的 CARTRIDGE 中。

4. 取 210μl RESUSPEND 加入到 DIGEST 中，室温，500 rpm 震荡 10 min 并瞬时离心；

5. 每个样品中加入 50μl 步骤 4 中配制好的 DIGEST，37℃，500rpm 酶解 （2h）；

6. 酶解结束后加入 100μl STOP 溶液，室温 500 rpm 震荡 1 min 终止酶解反应；

7. 连接好并加载有肽段的 CARTRIDGE，3800rcf 离心 1min（可根据需要调整离心时间以使样品全部离心下去）；

8. 加入 200μl WASH 1，3800rcf 离心 2min，清洗肽段，重复操作一次；

9. 加入 200μl WASH 2，3800rcf 离心 2min，再次清洗肽段，重复操作一次；

10. 使用 ADAPTER 将 CARTRIDGE 安装在新的肽段收集管中，加入 100μl ELUTE，3800rcf离心 2min，洗脱肽段，重复操作一次并将两次的洗脱液合并；

11. 洗脱的肽段样品于真空离心浓缩仪中离心浓缩。

12. 抽干后LC-LOAD复溶（1-4 15ul复溶，5-6 30ul复溶）;

13. 质谱上机（5ul） 。

检测方法

质谱条件：Lumos

梯度：1h，色谱柱 ionoptics 25cm

采集方法：DDA

质控：PSM 肽段 蛋白水平全部1%

除了蛋白数量差异，微量样品处理很重要的一个指标是漏切率：

常规方法处理微量样品漏切率接近50%，而iST试剂盒处理的漏切率基本在10%以内，和处理大量样品的结果保持一致。

另外我们采用开放式翻译后修饰分析后发现，因为试剂比例控制较难，常规方法的非特异性还原烷基化比例偏高（约10%），而iST方法则保持了同样的高水准。

PS:有人会问为何你之前测试都会加入肽段水平比较，而本文却偷偷去掉了呢？其实是因为微量样品处理的常规步骤带来的高比例漏切和非特异性酶切大大增加了无效肽段的检测数量，反而影响定量准确性，故不在此进行比较。

红色：特异性还原烷基化，青色：非特异性还原烷基化，蓝色：脱酰胺化，黄色：氨基甲酰化。上图为常规步骤，下图为IST步骤结果

在细胞测试中获得了理想结果后，我们信心十足的来到了几个VIP客户实验室，好说歹说的借了一些实际组织样品进行测试，立刻打消了客户采购昂贵前处理专门设备再进行微量实验的既定计划。

PS:数据多来自客户自行分析，但保证质控水平一致，结果展现形式会有差别。

1. 客户A: 微量黑色素瘤穿刺组织（有血液污染）
   
   

   

   
   

   质谱检测：EvoSep+timsTOF pro  

   梯度：44min  

   采集方法：DDA

   质控：PSM 肽段 蛋白水平全部1%

   结果：
   

   

2. 客户B：肿瘤组织FFPE（一片）
   
   

   
   
   

   质谱检测：Lumos

   梯度：1h，色谱柱 ionoptics 25cm

   采集方法：directDIA

   质控：肽段 蛋白水平全部1%

   结果：Protein Group
   

   
   漏切比例
   

3. 客户C：微量组织，小鼠，1个耳蜗

质谱检测：HF-X

梯度：1h
采集方法：DDA

质控：PSM，肽段，蛋白水平全部1%

结果：Protein Group

漏切比例

结论

1. 无论用户第一次上阵操作还是我们操作，采用iST方法均可得到理想结果

2. iST试剂盒完全适用于1-100ug蛋白的前处理且无需优化方法；

3. 酶切效率和修饰比例方面iST试剂盒结果更优；常规方法漏切率过高，一部分原因是酶解体系过大造成的；

4. 鉴定数量，蛋白水平iST试剂盒优势明显；

5. iST对于微量组织也能高效兼容。