Mann的数据好真的是因为质谱和你不一样？看看不升级质谱如何轻松做到2小时定量8000蛋白

本文相关数据易算将于2020年12月4日在西湖大学举办的 

Matthias Mann教授的蛋白质组数据经常被我们拿来膜拜、对比、效仿。他用的色谱柱填料、质谱参数、质谱方法、分析思路也是我们逐字逐句学习的教科书。

在我们用了他的填料、质谱参数、检测方法后，经常会发现我们的结果依然不如他，于是圈中纷纷流行起这么一个说法：Mann的质谱和我们的只是外观一样，里面都不一样。笔者无法钻进Mann的质谱里一探究竟，但可以为大家揭开Mann的结果优秀而我们很少注意到的另一个问题：样品制备。

在近几年Mann的文章中经常出现的一个前处理方法是：PreOmics iST，该方法源自Mann自己发表的Nature Method文章

它的原理一点也不神秘，和众多一体化样品制备的路线大同小异，最大的区别就是，它商品化了，Mann也是天天在用。

因此该方法往往被认为和平时各个实验室自行操作用的传统方法大同小异，何必徒增成本呢？

我之前也是这么想的，直到最近收到测试kit和配套设备PreON后才拨云见日，原来差别真的很大。

下面直接上干货！

我们利用现有材料和机时空余，做了如下测试对比，FASP或TCA对比处理均由客户课题组多年经验的工作人员手动完成进行对比，iST均由配套自动工作站PreON无干涉全自动化完成，均等量上机。

所有数据均单针nano-LCMS采集、定性、定量，DIA数据不进行谱图库匹配，只用DirectDIA分析。

如您想自行下载分析，可以通过点击最下方原文链接下载。

Hela细胞系以及更加优化的条件下的极限测试正在进行中，我们会定期在公众号中更新我们的最新结果。

我们采用2种状态人血浆，各2个生物学重复，DDA非标（不做Match between run），质控标准为1%PSM，1%Peptide，1%ProteinGroup FDR，分析软件为SpectroMine，全部默认参数，数据库为Swissprot human 2020年7月版本，共约20400条序列

下面几张图，样品顺序均一致，从左到右依次是FASP Top14去高丰度 S2组2重复，S4组2重复，FASP S2组2重复，S4组2重复，PreON BCT S2组 2重复，S4组2重复

可以看到iST方法做到了远高于人工处理FASP步骤的鉴定结果。PSM数量最多，蛋白略少于去高丰度方法，但总体鉴定率更优。在常规的1小时非标结果中也可以轻松实现最严格质控标准下400PG的数量。

定量蛋白丰度热图和相关性系数分析可以看到，PreON-iST结果的生物学个体重复的定量结果相关性也优于人工处理。

样品制备步骤的不可靠会带来各种各样的影响，漏切率、非特异性酶切、非特异性还原烷基化、高比例的氧化、脱酰胺化、非自然的N末端修饰、盐污染等等都是影响最终结果的意外因素。对此我们也进行了评价，质控标准为1%Peptide，1%ProteinGroup FDR，分析软件为pFind，数据库同上。结果如下表：

尽管可以通过培训、方法优化减少人工处理的意外因素，但人员流动，多人平行处理，试剂耗材批次和重复劳动疲劳等带来的可靠性问题依然无法消除。PreON将所有问题一并解决，再无后顾之忧，大样本处理不再成为您的苦恼。

  小鼠视网膜结果

我们可以看到无论ProteinGroup还是Peptide数量，iST均远远优于TCA方法，显示出该方法不仅仅能够更深度的覆盖目标样品的蛋白质组，更在肽段水平提供了丰富的可定量信息。

我们进一步查询了近几年相关研究的结果，可以发现该定量结果提供了远超传统方法的覆盖深度

  定量质控

和血液分析结果类似，漏切率进一步降低为4-6%，非特异性酶切<1%，非特异性烷基化0。

定性效果超群，那么定量效果如何呢？

未归一化前，定量信号分布，最高与最低信号差异不超过20%

组内定量相关性系数均大于0.95

各样品蛋白质定量强度分布一致，缺失值情况均<10%

（蛋白水平定量值采用Top3 肽段强度中位数Log10信号，纵坐标为蛋白Id，横坐标不同样品，黄色到蓝色代表高丰度到低丰度）

从上往下依次为12个测试样品TIC，可以发现总的TIC差异不大，但结果却差距明显。

那么iST比传统方法多鉴定蛋白可能的原因是什么呢？我们从蛋白分类上进行了分析，发现两者并无明显区别，而从各个蛋白的定量信号强度分析，见下图

可以发现大部分蛋白的信号强度两种方法基本相似，但中低丰度蛋白明显iST方法得率会更好些。我们在原文链接中也放了定量蛋白列表，感兴趣的老师也可以帮助我们总结下是否存在我们还未考虑到的因素哦。

现在，易算和PreOmics携手将Mann的一大利器带进中国，让Mann的数据不再神秘，您，也一样可以做到相似的结果。

iST商品化试剂盒外观

iST试剂盒包括裂解、还原、烷基化、酶解、除盐清洗步骤所需所有试剂，操作量从1微克-100微克蛋白，兼容常规鉴定、非标记定量和TMT标记定量步骤

配套自动化工作站PreON外观，高81 cm，宽 65 cm，深 62cm，放在实验台上使用即可。

其中iST及其改进版本BCT,iST-NHS均可和PreON自动移液工作站联用

• Hörnberg, H., Pérez-Garci, E., Schreiner, D. et al. (Nature 2020)

Rescue of oxytocin response and social behaviour in a mouse model of autism. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2563-7 

• Djeghloul, D., Patel, B., Kramer, H. et al. (Nature Comm 2020)

Identifying proteins bound to native mitotic ESC chromosomes reveals chromatin repressors are important for compaction. 
https://doi.org/10.1038/s41467-020-17823-z

• Blume, J.E., Manning, W.C., Troiano, G. et al. (Nature Comm 2020)

Rapid, deep and precise profiling of the plasma proteome with multi-nanoparticle protein corona. 
https://doi.org/10.1038/s41467-020-17033-7

• Mueller et al. (Nature 2020)

The proteome landscape of the kingdoms of life.  
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x

• Bader et al. (Mol Sys Bio 2020)

Proteome profiling in cerebrospinal fluid revealsnovel biomarkers of Alzheimer’s disease. 
https://www.embopress.org/doi/10.15252/msb.20199356

• Zaugg et al. (FASEB Journal 2020)

Gestational diabetes mellitus affects placental iron homeostasis: Mechanism and clinical implications.
https://faseb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1096/fj.201903054R