翻译后修饰蛋白质组学

Modification map

不同修饰需要不同化学与分析策略

修饰的丰度、稳定性、化学性质和发生残基不同，决定了样本处理、富集材料、碎裂方式和搜索参数。不能用单一流程覆盖所有 PTM，也不能把不同证据层级合并解释。

先明确要回答的是信号通路、蛋白降解、糖链结构、氧化还原状态还是药物反应，再选择修饰路线。

磷酸化

常见于 Ser/Thr/Tyr，关注激酶信号与动态调控；通常需要 IMAC 或 TiO₂ 富集。

泛素化与类泛素化

常以 K-ε-GG 残基抗体富集，连接蛋白降解、信号与应激反应。

糖基化

N-糖、O-糖和糖肽结构层级不同，位点、糖链组成与完整糖肽需要不同方法。

乙酰化与其他酰化

涉及染色质、代谢和蛋白稳定性，需控制化学背景与抗体选择性。

Cys 与氧化修饰

反映氧化还原和反应性位点，样本暴露、烷基化和交换反应会显著影响结果。

蛋白水解与末端组

关注内源性切割和蛋白加工，需要区分样本处理造成的人工切割。

Experimental route

实验路线围绕保留修饰和减少背景设计

修饰可能在取材、裂解、还原烷基化和消化过程中丢失或被人工引入。样本处理必须与修饰化学性质匹配，并设置总蛋白、富集空白和过程 QC。

PTM 富集是选择性步骤。富集后看到的是“被该化学或抗体流程捕获的肽段”，不是样本中所有修饰分子的无偏普查。

快速取材

抑制磷酸酶、蛋白酶或氧化反应，控制处理时间。

总蛋白基线

保留未富集 aliquot，用于蛋白丰度和样本 QC。

特异富集

按修饰选择材料、抗体、洗脱和分级策略。

适配碎裂

根据修饰稳定性选择 HCD、ETD/EThcD 等策略。

独立验证

用靶向质谱、突变或功能实验复核关键位点。

环节	主要风险	建议控制
样本处理	修饰脱落、交换或人工氧化。	统一时间、温度、抑制剂和暴露条件。
富集	批次差异、非特异结合和容量饱和。	固定投料、平衡材料、保留 flow-through 与 QC。
分级	回收率下降和样本丢失。	根据输入量决定是否分级并记录合并方式。
质谱	中性丢失、低丰度和定位离子不足。	优化碎裂、循环时间和修饰特异采集。

Localization and quantification

位点定位和定量是两个独立问题

同一肽段含多个可修饰残基时，碎片离子必须能够区分具体位置。定位概率高不代表定量没有干扰；定量稳定也不代表位点被唯一定位。

结果表应同时保留修饰肽段、位点、定位概率、修饰形式、蛋白 accession、肽段强度、缺失和蛋白丰度校正信息。

修饰组差异分析火山图示例 — 火山图只显示效应与统计显著性。每个点仍需回到修饰肽段、定位概率、定量峰组和总蛋白变化复核。

定位置信度

使用位点决定离子评估残基位置；多位点肽段需要特别检查等价定位和异构体。

修饰占有率

修饰肽强度不是占有率。绝对占有率需要同时估计修饰与未修饰形式并处理响应差异。

蛋白丰度校正

修饰变化可能由总蛋白变化驱动。配对总蛋白组有助于区分 abundance 与 site regulation。

Mechanistic interpretation

从位点变化走向机制需要多层证据

位点差异应结合序列保守性、结构位置、上游酶、时间顺序、通路背景和功能实验。仅凭数据库注释或 motif 富集不能证明某个激酶直接调控该位点。

把“检测到”“显著变化”“与通路相关”“直接酶-底物关系”和“具有功能后果”分层表述。

稳定鉴定

肽段、碎片、定位和定量峰组可复核。

重复变化

跨重复、批次或队列保持方向与效应。

上下游关联

结合 motif、激酶、结构与通路证据提出机制。

扰动响应

使用抑制剂、时间序列或遗传扰动观察一致变化。

功能验证

位点突变、活性、定位或表型实验验证因果。

通路层

对位点映射后进行激酶底物、motif 或功能模块分析，报告背景集和多重检验。

结构层

判断位点位于无序区、结构域、界面或活性区域，并显示结构置信度。

药靶层

药物引起的 PTM 变化通常是下游响应；直接占靶仍需 CETSA、竞争、LiP-MS 或其他正交证据。

药靶化学蛋白质组学 DIA-LiPQuan

Validation and delivery

报告需要把位点证据、定量证据和生物学证据分开

可交付结果应支持从蛋白到修饰肽段、具体位点、碎片离子、定量峰组、统计结果和外部注释逐级追踪，并明确验证状态。

关键候选优先满足：定位明确、峰组稳定、重复一致、效应具有生物学意义，并可设计唯一或高特异的靶向肽段。

鉴定序列、修饰、位点、定位概率、FDR。

定量峰组、缺失、CV、effect size、总蛋白校正。

解释结构、上游酶、通路、保守性与证据来源。

验证PRM、合成肽、扰动、位点突变或功能实验。

结论层级	最低证据	推荐补充
检测到修饰位点	受控 FDR、可解释碎片和定位概率。	独立 run 或合成肽复核。
位点发生差异	稳定定量、合理统计和多重检验。	总蛋白校正与独立样本。
上游酶可能参与	motif、已知底物或扰动一致性。	酶抑制、敲降或体外反应。
位点具有功能	时间、剂量或表型关联。	位点突变与功能救援。

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