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SpectroDive Prepare

SpectroDive Prepare

Targeted method development 覆盖 panel generation、panel import、panel splitting、 modified panel、RT calibration、method export 和 SureQuant。核心在于把 panel 结构、RT 校准和方法导出连成一条完整的方法开发链。

从课程定位开始
Panel 到 Method 一条线学完 PRM / MRM / SureQuant 通用 RT calibration 与调度方法 方法开发与上机练习

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panel generation RT calibration method export SureQuant

Orientation

Prepare 作为方法开发台

相比 discovery 软件，SpectroDive 的核心挑战不在“找到尽可能多的蛋白”，而在“如何把有限目标物设计成稳定、可调度、可解释的 targeted assay”。Prepare Perspective 正是承载这个任务的地方。

SpectroDive layout structure
SpectroDive 布局。Prepare 只是其中一个 Perspective，但它决定了后面 method export 和 analysis 的质量上限。

SpectroDive 方法开发流

从 library / FASTA / sequence list 到 panel、RT calibration、method export 和 targeted analysis 的关系图。

Prepare Perspective 的三步结构
  • Prepare Perspective 的三步结构是：生成或选择 assay panel、可选地指定 RT calibration run、再选择参数并导出 scheduled 或 unscheduled instrument-specific method。
  • 这三步的排列很重要，因为它意味着 method export 不应先于 panel 和 calibration 被讨论。学生只要一上来就问“怎么导出方法”，通常都会把前两层逻辑跳掉。
  • 这套流程同样适用于 MRM / PRM、SureQuant 和 hybridDIA，说明 Prepare 的本质是方法开发台，而不是某一种 acquisition 的专用页面。

Panel Sources

Generate Panel

SpectroDive 支持三类 panel 来源：spectral library、FASTA 和 sequence list。三类来源对应不同的知识基础和质量边界，不能混作同一种输入。

从 spectral library 开始

这是最稳健、也最接近真实观测谱图的 panel 来源，适用于 biomarker 验证、候选迁移和有历史项目积累的实验室。panel 不是一份清单，而是 library 中 assay 信息的 targeted 选择。

从 FASTA 做 in-silico panel

这条路线适用于没有现成 library、但目标蛋白明确的场景。它把 digestion rules、charge states、修饰和 fragment selection 提前编码进 panel 设计过程。in-silico 不等于任意生成，它仍然依赖明确规则。

从 sequence list 开始

这一路径适用于已有目标肽序列、想快速构建 assay panel 的情况。sequence list 更像人工定义入口，后续依然要补齐 charge、fragment、label 和 iRT 等关键信息。

panel 来源 适合什么情况 最容易踩的坑
Spectral Library 已有 discovery 结果、已有历史库、已有 commercial panel 文件 把 library 里的 assay 当成最终 panel，不再做 targeted 层面的筛选和 split
FASTA / in-silico 目标蛋白明确但没有现成实验库，希望快速建立理论 panel 低估 digestion rules、修饰、charge 和 fragment 过滤对 panel 质量的影响
Sequence List 已确定目标肽段，想快速搭一个初版 assay panel 只给序列，不补齐 iRT、fragment、label 和 response factor 等后续关键字段
按 5.3.1 顺序展开：Generate / Import panel 的关键步骤是什么
  • 从 library 启动时，先选 library，再决定是否添加 in-silico generated precursors，并可选择只补 identified proteins 的未识别 precursors，或也补 non-identified proteins 的 precursors。
  • 随后可按 precursor m/z、peptide length 等条件预筛 precursors，并按 ion type、neutral loss 等规则筛 fragments。这说明 panel generation 本质上已经是方法学设计，而不是单纯导入。
  • Import panel 时需要使用 plain text separated value 格式，并确保列名能被 Import Manager 映射到 SpectroDive 的特定字段；若缺失 mandatory 或 recommended 列，软件会明确警告。
  • 用户自定义列名同义词会被存入 Databases → Table Import，说明 panel import 也是可持续学习和标准化的过程，不是每次都重新匹配列头。
panel 来源先于导出方法的原因
  • 因为 method export 只是把已有 panel 编译成仪器方法，真正决定方法上限的是 panel 从哪里来、信息完整度够不够、是不是带着正确的 transition ranking 和 iRT。
  • 如果一开始就忽略来源差异，后面就会把所有问题都归咎于导出参数，但实际上很多问题早在 panel generation 阶段就已经埋下了。
  • 这一章的学习成果不应只是“会生成 panel”，而应能区分 library-based panel 与 FASTA / sequence list 起步在不同项目中的适用边界。

Panel Schema

Q1、Q3 与 iRT 骨架

panel 字段是 SpectroDive 最值得反复训练的内容之一。因为一旦这里定义含糊，后面的调度、峰提取、绝对定量和 refinement 都会失去基础。

字段 在软件里的作用 关键解释点
Q1 / Q3定义 precursor 与 transition / fragment 的理论 m/z绝不能随意四舍五入，它直接决定 transition 是否能被正确调度和识别
iRT把保留时间投影到标准化坐标系如果 iRT 错，scheduled window 和峰提取都会出问题
RelativeFragmentIntensity帮助 transition ranking 与信号优先级判断不是装饰列，它会影响检测限和 fragment 选择
ModifiedSequence / ProteinId连接位点、肽段和蛋白归属如果想做修饰位点或标记通道，这两列必须提前规划
CompensationVoltage / IonMobility连接 FAIMS、TIMS 或其他离子淌度相关采集条件这是高级 targeted workflow 的正式字段，不该等到后面分析时才想起
PeptideResponseFactor / ProteinScalingFactor服务绝对定量和浓度换算如果只在分析后才想起这些字段，通常已经太晚

哪些列是“缺了就不能做”的骨架

Q1 / Q3 / iRT / Sequence / Charge / Fragment 这些列决定 transition 身份和调度边界。它们缺失时，不是信息少一点，而是方法逻辑本身不完整。

哪些列决定你能不能把项目升级到绝对定量或高级 workflow

ResponseFactor、ScalingFactor、CompensationVoltage、IonMobility、label 相关列会直接决定这个 panel 是不是只能做“能跑”的基础版，还是可以进入绝对定量和高阶调度。

按 Table 6-7 顺序展开：哪些列是 panel 的必填骨架，哪些列是绝对定量增强项
  • Q1 和 Q3 必须保持理论 m/z 精度，不能四舍五入，因为这会直接影响 transition 的准确性。
  • iRT 是最关键的调度列之一。若没有经验 iRT，软件可以预测；但 empirically determined iRT 会显著提升速度与结果质量。
  • RelativeFragmentIntensity 不是装饰性信息，它能改善 detection limit；StrippedSequence、PrecursorCharge、FragmentType、FragmentNumber、FragmentCharge 和 ModifiedSequence 共同定义 transition 身份与打分语义。
  • 绝对定量增强项主要是 PeptideResponseFactor、ProteinScalingFactor 及其单位列。这些列定义了如何把 target/reference ratio 变成 peptide 或 protein absolute quantity。

RT Calibration & Export

RT Calibration 与 Method Export

Prepare Perspective 的真正难点不在于导出一个方法文件，而在于先建立 RT calibration、split panel 和 calibration run 对 method export 质量的约束关系。

Prepare iRT calibration
Edit Recalibration。这里集中展示 iRT peptide 的筛选、拟合曲线和 calibration 对调度窗口的影响。
Export method
Exporting Method Files。窗口并发、retention time window 与 concurrent transitions 的平衡都在这里处理。

split panel 的作用

当 panel 太大、同一时间窗口内并发 transition 过多时，信噪比和 dwell time 会受到压力。split panel 不是多做一步麻烦事，而是确保方法可执行、可灵敏、可稳定的基础设计。

RT calibration 不是形式步骤

线性、非线性、library-based calibration 和 DIA-based calibration 的选择，决定了 method export 的时间调度是否可靠。RT calibration 的质量直接影响后续峰提取和绝对定量的可信度。

校准路线 应用前提 适用项目
unscheduled MRM / PRM + iRT kit 先跑包含 iRT peptides 的宽松方法，再建立线性 calibration 最标准的入门路线，适合从零起步的 scheduled method 训练
panel-based run + 线性 / 非线性 calibration 先用宽窗口或宽松版本 panel 采一轮，再回到 Prepare 重建调度 更接近真实大 panel 项目，适合正式方法开发
DIA-based calibration 目标物已经包含在同色谱条件的 DIA 数据中 想利用 discovery / survey run 为 targeted 调度赋时
library-based calibration 已有同色谱条件下生成的 DDA / DIA spectral library 有稳定历史库和成熟平台时，最快进入 scheduled method
按 5.3.1.2-5.3.1.3 与 Box 4-5 顺序展开：从 split panel 到 scheduled / absolute quant method 的标准路径
  • 若 panel 太大，应先通过 Split… 把它分成若干子 panel，并按 iRT 范围均匀分配 assays；若 panel 含 decoys，它们会被复制到每个 split 中。
  • Generate Modified Panel 则允许从已有 panel 中更细地选择 precursors / transition groups，或重新定义 labelled channels。也就是说，modified panel 更像“精修方法版本”，不是简单复制一份 panel。
  • RT calibration 有四条正式路线：用 unscheduled MRM / PRM run 加 iRT kit 做线性 calibration；用更宽窗口的 panel-based run 做线性或非线性 calibration；用带 panel peptides 的 DIA run 做非线性 calibration；或直接从相同色谱条件下生成的 DDA / DIA spectral library 导入 calibration。
  • Box 4 的 scheduled acquisition 标准路径是：先生成 panel，再导出 unscheduled method，完成 unscheduled acquisition 后在 Analysis 里生成 RT calibration run，再回到 Prepare 用该 calibration 导出 scheduled method。
  • Box 5 的 absolute quant method 标准路径则要求 panel 中提前包含 SIS 相关列，例如 PeptideResponseFactor 和 ProteinScalingFactor；采集完成后即可在 Analysis 中看到绝对量，并在 Report 里导出 EG.AbsoluteAmount 和 EG.ProteinAbsoluteAmount。
  • 并发 transitions 过多会损伤 dwell time 和 signal-to-noise ratio，MRM 经验阈值也正是围绕这一点建立的，因此 concurrent transitions plot 属于方法可行性检查器，而不是附属图表。
导出方法这一页真正该形成什么判断
  • 不是所有 panel 都应该直接导出 scheduled method。若当前 iRT 质量不足、并发 transitions 太高或 calibration 还不稳定，先导出 unscheduled / 宽窗口方法反而更安全。
  • 若目标是绝对定量，导出前就必须确认 panel 中是否已经带齐 response factor、reference / target 关系和单位列；否则后面 Analysis 再精细，也只是在补救准备阶段的缺口。
  • 因此 method export 最终要回答的不是“哪个按钮能导出”，而是“当前这个 panel、这组 iRT、这类仪器和这类样本复杂度，是否已经到了值得固化成正式方法的程度”。

Advanced

SureQuant 与高阶调度

Prepare 末尾加入 SureQuant，是为了说明 SpectroDive 不仅支持常规 scheduled PRM / MRM，也支持更复杂的 triggered acquisition 思路。

SureQuant 的关键结构

重点不在于记住这个名字，而在于理解它如何利用 reference channel 或触发逻辑，在复杂基质和低丰度目标物条件下提升 targeted acquisition 的有效性。

这一章的方法开发价值

panel generation、split、RT calibration、method export 和 SureQuant 本质上回答的是同一个问题：如何把目标物变成一套能在仪器上稳定运行的方法。

步骤 1：定义 survey run

先导出并采集一套 SureQuant survey method，让 reference channel 和目标物在真实样本里先“探路”。

步骤 2：分析 survey run 并设阈值

回到 Analysis 中查看 survey run，根据真实 peak 行为决定触发阈值，而不是凭经验拍脑袋设默认值。

步骤 3：导出正式 SureQuant method

把触发阈值、panel 和仪器兼容条件一起固化成最终方法，再进入正式样本采集。

SureQuant 元素 模块职责 学生应如何理解
Survey Run 先测参考通道和触发行为，再决定正式 acquisition 它不是多余预实验，而是正式方法设计的一部分
Peak Fraction 定义触发高分辨 MS2 的阈值比例 默认值只是起点，必须随 panel 大小和样本复杂度优化
TargetMass / TargetMassTrigger 导出为最终 method folder 中的核心文件 说明 SureQuant 最终交付的是一套结构化方法包，而不是单个参数
按 5.3.1.4-5.3.1.5 顺序展开：SureQuant 是怎样从 survey run 走到正式方法的
  • SureQuant workflow 分成 3 步：先定义 survey run；再采集并分析 survey run 来设置触发阈值；最后用定制好的 SureQuant acquisition 采集样本并分析。
  • 若使用自定义 panel，先在 Prepare 中选择 SureQuant 兼容仪器并导出 survey method；之后在 Analysis 中用 survey run 建立 experiment，再从 experiment tab 右键导出 SureQuant method。
  • 导出的 method folder 中包含 TargetMass、TargetMassTrigger 和 ReadMe 文件，说明 SpectroDive 已把 SureQuant method 组织成可直接交付给仪器软件的结构化包。
  • 全局 Settings → Global → SureQuant 中最重要的参数是 Peak Fraction，它定义 mono-isotopic peak height 的百分比阈值，用于触发高分辨 MS2 扫描。1% 可作为默认起点，但必须随 panel 大小优化。

Next Steps

后续模块

最好的顺序是先完成 panel 与方法开发，再立刻进入 Analysis 课程，学习 calibration curves、review、panel refinement 和 iRT refinement。

Analysis 模块

继续学习 targeted analysis、绝对定量、refinement 与 review。

打开 Analysis 课程