SpectroDive Analysis

Analysis Perspective 包含四项正式任务。第一，建立 targeted data analysis，把真实 run、panel 与 analysis schema 结合起来完成定量和识别。第二，建立 scheduling analysis，服务 method export 前后的调度验证。第三，建立 panel iRT refinement analysis，把实际采集结果回写到 panel。第四，加载保存的 SpectroDive experiment 继续复核。

这一章的核心是分清对象类型。raw file、panel、analysis schema、calibration curves file、condition setup 属于前置输入；review judgement、refinement changes、saved experiment 属于分析阶段沉淀出来的文件。把这两类对象分开之后，绝对定量和 refinement 的逻辑才会稳定。

这段向导可以按 6 个连续问题来学。第一，你准备分析哪些 run，也就是从 file 还是 folder 导入 raw files。第二，你准备用哪个 panel 去提取它们，这决定了软件会去哪些 precursor 和 transition 上找信号。第三，你是否要启用 calibration curves，如果是，就必须同时指定一个或多个 .ccs 文件。第四，你这次分析打算采用哪套 analysis schema，也就是 Identification、Quantification 和 Post Analysis 的底层规则。第五，你的实验条件和重复设计是什么，这一步由 Condition Setup 承担。第六，你是否准备好让软件开始根据 iRT kit 做自动校准，点击 Finish 后这一流程会立即开始。

Condition Setup 的内容比很多人想象中更细。它不仅包含 condition、biological replicate 和 fraction，还包含 Run Label、Is Reference 与 quantity correction factor。前两个字段主要进入 plotting 和 reference-based normalization，后一个字段则会直接乘到最终数量上。也就是说，Condition Setup 并不只是为了做一张颜色漂亮的后分析图，它其实是整个统计设计的输入层。

Condition annotation 提供 3 条导入路径：使用 file name parsing schema 自动从文件名解析、直接在表里手工编辑、先导出当前 setup 再修改为文本文件重新导入。自动解析对应标准化批处理，手工编辑对应小规模试验，文本导入对应固定模板项目。conditions editor 对空格和大小写敏感，因此条件命名会直接影响统计分组。

点击 Finish 后，系统会先自动检测 iRT kit，并按每个 run 的数据特征校准分析参数。这一步直接决定处理速度、specificity 和 automated QC，因此底部 progress bar 完成初始校准之后，才进入稳定浏览状态。

• LLOQ 是可接受准确度和精密度的最低可定量点，不等于刚刚看得见。
• LOD 是检测下限，表示可以检出，但并不等于可以稳定定量。
• ULOQ 是仍保持线性响应的最高可定量点。
• AbsoluteAmountRangeLimitted 这种字段的意义，在于提醒你“有数值不代表在可报告区间内”。
• dilution factor 和样本准备历史必须进入计算链，否则绝对量会失真。
• .ccs 不是普通附件，而是 calibration curve set 的正式文件，应该像 panel 一样被版本化管理。

这一套 calibration curves workflow 必须按步骤理解，而不是只记住“导入一个 .ccs 文件”。第 1 步是先搭建一轮专门用于生成 calibration curves 的 targeted analysis：选择 calibrant runs，并指定本次分析对应的 protein panel。第 2 步是在 Workflow 节点定义 experiment type，例如当 light endogenous peptide 保持恒定浓度、heavy 标准做稀释系列时，应采用 inverted spike-in，并让 light peptide 成为 identification 的 reference channel。第 3 步是在 calibration curve 节点勾选 Process as Calibration Curve，并检查 Concentration variation on peptide type 的设置是否与实验设计一致。第 4 步是录入每条 peptide 的标准量信息；如果使用 Biognosys panel，一部分起始量可自动带入。第 5 步是定义 condition setup，尤其是 blanks、未稀释样本和各个稀释倍数的 dilution factor。第 6 步是在 Analysis Perspective 中复核生成结果，并把 calibration curve set 保存成 .ccs 文件。第 7 步才是启动真正的 quantitative experiment：加载待定量 run、指定相同 panel 和刚保存的 .ccs 文件。第 8 步是在 quantitative analysis 里保留 workflow type 的设置，但跳过 calibration curve generation 节点，因为这一步已经在前面的 calibrant analysis 中完成了。

第 6 步生成的是定量模型，第 7 步使用的是定量模型。前者输出 .ccs 文件，后者输出未知样本的绝对定量结果。把这两步分开，同一套 calibration curves 就能被多个实验重复使用，several calibration curves 也能为不同 precursor 选择最优曲线。

校准曲线 revision 这一页可直接按图阅读。绿色菱形表示该 calibrant run 中被高置信识别到的肽；x 轴是基于起始量和 dilution factor 计算得到的 nominal concentration；浅蓝色方框是通过校准曲线反推得到的实际定量值；低于 LOD 的点会以橙色框表示，提示它已经落到噪声底；红色虚线表示 blanks 的平均强度，对应背景噪声与信号分离程度。

如果在 Condition Setup 中定义了 replicates，图上还会出现统计离群值的三角标记，垂直误差线则反映每个 calibrant level 的强度 CV。读图时应同时检查三点：该 precursor 在 LLOQ 和 ULOQ 之间是否有足够多的点支撑线性区间；blanks 是否足够低；quantified value 是否稳定落在可报告范围内。

默认 tree hierarchy 为 Run → Panel → Elution group → Precursor → Transition。Accept 和 Reject 针对 identification judgement：一个 elution group 被手工接受后，会被当作已识别对象；被手工拒绝后，会被当作未识别。Exclude 更偏结果与计算层：排除 elution group 或 transition group 后，它不会出现在 report 中；排除 transition 后，它既不会参与 quantification，也不会参与 scoring。Hide 只影响当前图形显示，不改变定量和报告；Delete 会把对象从 panel 中彻底移除。

排除或删除 fragment 后，父级 elution group 不会立刻重打分。要让修改真正回到 score 和 q-value 上，必须在 experiment tab 中点击 Process Pending Changes。

Tree filtering 与 tree grouping 是另一层组织能力。Filtering 只影响 Analysis Perspective 中显示哪些对象，不会自动改变 Post Analysis；Grouping 用来把复杂结果按 protein 或 panel 等方式重新组织。review 前应先确认 filters 是否启用，再确认当前分组方式。

• 导出专门的 iRT Refinement run type，而不是拿普通 analysis 方法硬改。
• 系统会自动使用更宽的窗口，并默认只保留两个 transitions，以适配 refinement 目的。
• 只有手工接受的 peptides 才会进入 iRT refinement，因此 review 质量会直接决定 refinement 结果。
• 完成后仍需 commit panel changes，否则这次 refinement 不会进入下次方法导出。

无论是 fragment selection refinement 还是 iRT refinement，本质上都属于 panel refinement，而 refined panel 会回写到 Prepare Perspective。也正因为如此，Prepare 中才提供 Reset to Factory Default 作为回退入口。

Fragment Selection Refinement 的重点在于“用真实采集结果筛掉不理想的 transitions”。PRM 不仅可以从 library 中已有 fragment 里筛选，也可以把 theoretical fragments 纳入候选，这意味着 PRM 方法优化并不只是在现有 panel 中做被动取舍。执行变更时，必须通过 experiment tab 的 Refine Assay Transitions 提交；如果是从 SPE 加载的 SureQuant 或 HybridDIA 实验，还要先执行 SureQuant → Re-extract Raw Data，否则这些变更不会体现在后续 refinement 中。

iRT Refinement 是 panel 迁移和方法早期开发的关键工具。先在 Prepare Perspective 导出专门的 Run Type = iRT Refinement 方法；这类方法会自动采用更宽的窗口，并默认每条 peptide 只保留两个 transitions。采集完这些 runs 之后，再用 Set up Panel iRT Refinement Analysis 建立分析，并在 experiment tab 中执行 Refine iRT。只有手工接受的 peptides 会进入 iRT refinement，完成 refinement 后仍需 commit panel changes。

SpectroDive 支持的 quantitative workflows 包括 label-free、labeled、spike-in 和 inverted spike-in。四者在 peak detection、scoring 与 post analysis quantification 的参考通道上并不相同，因此 workflow type 会继续影响 calibration curves、report 字段和结果解释。

SpectroDive 不会自动保存分析结果，因此需要主动执行 Save As… 或保存实验。保存下来的 experiment 会记录完整分析信息，包括手工积分的峰、comments、被排除的 transitions，以及某个 peak 是否被手工接受或拒绝。它使用 .spe 作为扩展名，并且可以在不依赖原始 raw file 或 panel 的情况下重新打开查看数据。

把关键 review 和 refinement 保存进 SPE 后，后续就可以反复回看当时接受某个峰或排除某条 transition 的依据。旧版本实验在升级过程中可能丢失某些 run-level 元数据，例如自定义标签、注释、原始 run 顺序和图形颜色编码，因此 SPE 文件同时也是版本迁移文件。