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plexDIA

plexDIA、channel-specific FDR 与多通道蛋白周转分析

plexDIA 把多通道标记与 DIA 采集结合起来，在保持高数据完整性的同时提高样本通量，并把同一 run 内的跨通道比较直接带入差异分析、周转分析与低输入实验。在 Spectronaut 中，核心不是“多出几个通道”，而是 channel sets、cross-channel quantification、channel-specific FDR、heavy/light transition 选择和报表字段如何共同决定最终结论。

从 multiplex-DIA 定义开始 Spectronaut labeled workflow plexDIA 的 FDR 控制
3-plex non-isobaric labeling Channel sets 与条件矩阵 GroupQ / MinQ / MaxQ / ChannelQ heavy / light transition selection pSILAC / turnover OmicsCloud 结果交付
6技术章节
4官方与文献来源
5关键实现点
Spectronaut 20 升级要点图 Spectronaut 20 已将标记实验、复杂搜索空间与 FDR 控制放进同一条分析主线，plexDIA 就落在这一层实现能力里。

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检索 plexDIA 检索 channel-specific FDR 检索 ChannelQ
plexDIA GroupQ ChannelQ turnover heavy/light transitions

Definition

plexDIA 不是普通 labeled workflow，而是多通道 DIA 的对象层重组

plexDIA 将非等重标签、多通道 DIA 与统一的峰提取和打分结构结合在一起。它带来的核心变化不是“在同一个 run 里测更多样本”，而是 同一 elution group 可以在多个 channel 中同时拥有共享证据和独立定量证据，因此数据完整性、跨样本对比和时间序列设计都可以明显改善。

与 label-free DIA 的差别

label-free DIA 主要在 run 间比较样本；plexDIA 则把多个 biological states 压缩进同一 run，使 run-level 变异被显著削弱，跨通道比较更直接。

与等重标签的差别

plexDIA 不是 reporter ion 读数，而是保留 MS1 / MS2 色谱行为与碎片信息。结果并不依赖单个 reporter channel，而是依赖整套 cross-channel peak extraction 与 scoring。

与普通 spike-in 的差别

普通 spike-in 多对应 reference ratio；plexDIA 则把不同 channel 看作实验对象本身，因此 channel set 的定义直接进入条件矩阵和统计结构。

读数层 label-free DIA plexDIA
比较单元 run 与 run 之间 同一 run 内 channel 与 channel 之间，同时保留 run 间比较
缺失值来源 run 间峰提取、采样与漂移共同影响 共享峰边界降低通道间缺失，剩余问题集中在通道特异干扰和打分层
典型场景 大队列 discovery、常规组织与体液 低输入、多时间点、turnover 和希望提高样本通量的 discovery 设计

2023 年 plexDIA 主文献给出的边界

Nature Biotechnology 的原始文献给出的结论非常明确：plexDIA 在同等仪器时间下可把蛋白组通量提升约 3 倍，在此前每个样本大约测到 5,000 个蛋白的条件下提升到接近 8,000 个蛋白，并在单细胞场景中实现约 1,000 个蛋白和 98% 的数据完整性。这些数字说明 plexDIA 的价值首先体现在 throughput 与 completeness，而不是单纯“命中数更多”。

plexDIA 的对象链

图中把标记、channel set、共享峰边界、通道级过滤和 turnover 读数组织成一条完整链路。点击节点可直接跳转。

Spectronaut

Spectronaut 用 channel sets 把 plexDIA 变成正式分析结构

在 Spectronaut 中，plexDIA 不靠额外脚本拼接，而是直接进入 labeled workflow、conditions 与 report 结构。真正需要记住的是： 先在 DIA Analysis Settings 里把 multi-channel 数据解释为 labeled workflow，再在 Condition Setup 里定义 run condition 与 channel set。light / medium / heavy 这些标签不只是列名，它们是 channel sets 的组成部分，决定跨通道定量、pairwise ratio 和后续 differential analysis 的语义。 如果前置 workflow 仍被解释为 Force Label free，或 From Library Annotation 没有有效 channel annotation 且 fallback 方向错误，Condition Setup 只能定义样本条件，不能把单个 precursor 重新变成多通道 elution group，也不会生成正确的 channel quantity 与 ratio 结构。

设置位置 plexDIA 中要确认什么 判断标准
DIA Analysis Settings → Workflow Multi-Channel Workflow Definition 选择 Labeled，或使用带 workflow annotation 的谱库并把 fallback 设为 Labeled。 peak detection 与 scoring 会作用于所有 channels，后分析才会把 channel ratio、channel set condition 和 run condition 组合起来。
Labeling / channel annotation 在进入 Condition Setup 前，确认 light / medium / heavy 或 A / B / C 等 channel 的 label 与 modification annotation 已经进入谱库或 analysis schema。 Channel Set tab 中每个 channel 都能显示明确的 Label 与 Modifications；如果这里只剩一个普通 label-free precursor，后续 conditions 无法补回 labeling 语义。
Run Conditions 给每个 run 指定 biological replicate、run-level condition、fraction、所属 channel set 与条件显示标签。 固定标签设计通常只有一个 channel set；label permutation 设计需要多个 channel sets。Run-level 的 Is Reference 用于运行层面的比较语义，不等同于 Channel Set 内部的 reference channel。
Channel Set tab 逐行定义每个 channel 的 biological condition、通道 label、modifications、reference 与颜色。 同一个 run 内的 channels 才会被解释成不同时间点、处理组或 heavy/light ratio 对象；这里的 Reference 描述 channel set 内部的参考通道或 ratio 方向。

先确认 labeled workflow

  • From Library Annotation 适合谱库已经携带 workflow annotation 的项目；没有 annotation 时必须确认 fallback 不会落到错误解释。
  • Labeled 是 plexDIA 的核心入口。多通道 assay 会在所有 channels 上做峰检测、打分和识别，后续按 ratio 或 channel set condition 进入定量。
  • Spike-in 通常以 heavy / reference channel 辅助 peak picking，target / light channel 进入 scoring 与 identification；Inverted Spike-in 则反转参考方向。二者不等同于 plexDIA 的多通道条件比较。
  • Force Label free 会把 multi-channel assay 当作 label-free 处理，通常不用于需要 channel-level quantity 的 plexDIA 项目。

再进入 conditions

  • Run Conditions 负责 run、replicate、fraction、channel set 编号和条件显示标签。
  • Channel Set tab 负责 channel 内部的 condition、通道 label 和 modification 映射；通道 label 必须和 modifications 一起定义通道身份。
  • 当 channels 多于两个时，channel sets 必须在 Condition Setup 中定义；两个 channel 的 labeled workflow 也可以按 channel set 方式管理。
  • 标签互换设计中，ABC、BCA、CAB 这类组合不是备注，而是不同 channel set。
Condition setup panel during DIA Analysis set-up
Run Conditions 定义每个 run 的 replicate、condition、fraction、channel set、reference 与 correction factor。进入这里前，应先在 analysis settings 中确认 multi-channel workflow 会按 labeled workflow 解释。
Channel set condition example with labels and modifications
Channel Set tab 是 labeled setup 的关键界面。每个 channel 都需要对应 condition、label 和 modifications；例如 DimethLys / DimethNter 这类标记直接决定通道身份。
Single channel set example
单一 channel set 对应固定标签语义的实验，多个 biological replicates 共用同一套 light / medium / heavy 定义。
Multiple channel sets example
多个 channel sets 对应 label permutation 设计，把不同 biological replicate 中的标签映射到不同条件，以降低 labeling bias。
Channel set condition example
同一个 biological replicate 内部的各 channel 既共享峰边界，也保持独立的 channel-level quantity 与过滤判断。

两种最常见设计

  • 固定通道语义：每个 run 都保持 light / medium / heavy 对应固定时间点或处理条件。
  • 标签互换设计：对不同 biological replicates 交换 label，抵消系统性 labeling bias。

Spectronaut 的实现重点

  • 所有 channels 会进入同一分析任务与同一 elution group 计算框架，并以 labeled workflow 方式同时计算。
  • channel sets 决定 regulation analysis 的基本对象，因此条件定义必须在 Analysis 阶段固定。
  • 最终输出不仅包含 protein / peptide 结果，还包含面向 channel 的定量与过滤字段。
Spectronaut labeled workflow 章节 查看报表字段层

FDR & Filtering

plexDIA 的关键升级不在通道数，而在 channel-specific FDR 与 transition 选择

Biognosys 在 HUPO 2024 与 Spectronaut 20 的官方资料中，把这条线讲得非常清楚：plexDIA 真正的难点不是“如何把多通道数据读出来”， 而是如何在共享峰边界的同时保持每个 channel 的独立可信度与定量精度。为此，channel-specific FDR 和 deep-learning assisted heavy/light transition selection 成为 Spectronaut 20 的核心升级点。

GroupQ

把所有 channels 当作一个整体，只要整体 elution group 通过，就保留全部 channel。覆盖最高，但更偏向整体定量轮廓，不直接承担严格的通道级差异结论。

MinQ / MaxQ

MinQ 要求至少一个 channel 独立通过 q-value 门槛，更偏向保留可定量对象；MaxQ 要求样本中的全部 channels 都通过门槛，是更保守的通道级过滤。两者分别对应 sensitivity 与 precision 的取舍。

ChannelQ

ChannelQ 把每个 channel 独立过滤，只保留该 channel 自身可信的定量结果。它直接对应 turnover、time-course 和 channel-level QC。

plexDIA 的过滤策略与输出边界

这张图不是性能排行榜，而是不同过滤策略在覆盖度、通道独立性与保守程度上的取舍关系。

设置层 作用 什么时候必须关注
channel-specific FDR 保证共享峰边界下每个 channel 仍有独立的可信度控制 多时间点、turnover、通道间强弱差异大时
heavy/light transition 选择 避免通道间同位素干扰把 transition 直接带偏 重轻通道 overlap 明显、低输入和复杂基质时
minimum log2 precursor quantity 过滤掉量级过低、无法稳定进入 ratio 计算的对象 需要稳定 fold change 或 turnover readout 时
common workflow settings 统一不同通道与不同时间点的 extraction 与 scoring 基线 跨 run、跨时间点比较时

这条升级线如何接回 SP20

Biognosys 官方在 ASMS 2024 和 HUPO 2024 的表述是一致的：Spectronaut 19 / 20 对 large and complex multiplex DIA datasets 的支持，不是把 labeled workflow 当成附录功能，而是通过 channel-specific FDR、transition 选择和报表字段，把 multiplex DIA 提升到正式 discovery 与 turnover 分析层级。也正因为如此，plexDIA 需要和 FDR、QC、report schema 一起学，而不是只停在 channel setup。

Turnover

Yansheng Liu 合作线把 plexDIA 推到了 protein turnover 读数

Biognosys 在 HUPO 2024 lunch seminar 和 Spectronaut 20 官方资料里多次强调，与 Yansheng Liu 团队合作的重点并不是再做一条 labeled workflow， 而是把 multiplex-DIA 直接推向 proteome-wide turnover rates。这里最关键的两项实现分别是 channel-specific FDR，以及面向 heavy / light 对的 deep-learning transition selection。

官方表述的技术含义

Biognosys 在 ASMS 2024 新闻中引用 Yansheng Liu 的说法：Spectronaut 19 已能在不牺牲数据完整性的前提下，高效分析每个 run 含有数万条肽段定量结果的 multiplex proteomics 数据，从而推进真实蛋白丰度与 protein turnover rates 的联合分析。这说明官方把 plexDIA 明确放到了 abundance + turnover 的双读数框架里。

2025 multiplex-DIA 文献给出的实现结果

Nature Communications 2025 的 multiplex-DIA 工作流在 A2780 细胞系的 4 个时间点、3 个生物学重复条件下，平均定量约 6,900 个蛋白；在 timsTOF Ultra 与 Orbitrap Fusion Lumos 的 pSILAC 跨平台设置中，平均可达约 9,130 个蛋白，并把梯度缩短约 2.5 倍。Exploris 480 与 timsTOF HT 的 dimethyl-labeling mDIA 数据则说明该思路也能扩展到 2-channel / 3-channel 标记设计。

从 multiplex-DIA 到 turnover readout

图中把时间点与标签设计、channel-specific filtering、stable ratio matrix 三类证据汇聚到 turnover fit；箭头表示依赖关系，不代表固定处理顺序。点击节点可跳转。

层级 plexDIA 要保证什么 否则会发生什么
通道设计 时间点、处理组和标签互换必须构成稳定的 channel sets 同一 run 内 ratio matrix 失真，后续 turnover 拟合直接偏移
过滤与 transition 每个 channel 的可信度和 heavy/light fragments 必须单独判断 弱通道被强通道掩盖，导致 turnover 曲线被高估或低估
报表层 需要保留 channel-level q-values、minimum quantity 过滤和 time-point 结构 导出后只剩 protein table，无法再区分真实 turnover 与 channel artifact

Implementation

plexDIA 项目的实施链条

这条路线不是只有采集和软件。低输入、多时间点、多通道 discovery 要同时处理前处理稳定性、nanoLC 分离、软件过滤和最终结果交付。

样本处理与自动化

多通道 low-input 设计对前处理一致性极其敏感。Auto120 / Auto150 与易肽前处理体系更容易把 digestions、cleanup 和 batch reproducibility 稳定下来。

进入产品与方案

上游分离与温控

plexDIA 需要更稳的 retention time 和更窄的峰形。Aurora Series、NanoShield 与 HeatSync 这类分离端配置，会直接影响 cross-channel extraction 与 turnover time-course 的精度。

IonOpticks 产品与技术

Spectronaut 与统一管理

Spectronaut 负责 labeled workflow、channel-specific FDR 与 channel-level reports；OmicsCloud 则负责结果共享、远程复核、项目留痕和最终交付。

Spectronaut labeled workflow / 产品方案架构

References

官方资料与主文献

下面这组资料覆盖 multiplex-DIA、Spectronaut 20、channel-specific FDR 和 turnover 的关键技术节点。

Biognosys：ASMS 2024 Spectronaut 19 新闻

官方首次明确把 large and complex multiplex DIA datasets 与 Yansheng Liu 的 protein turnover 应用放在同一条产品升级线上。

打开官方来源

Biognosys：HUPO 2024 Lunch Seminar

官方明确写出两项与 Yansheng Liu 合作开发的方法：channel-specific FDR，以及 deep-learning based heavy/light transition selection。

打开官方来源

Nature Biotechnology 2023：plexDIA 原始论文

给出三倍 throughput、约 8,000 proteins per sample、98% completeness 和单细胞 1,000 proteins 的关键边界。

打开文献

Nature Communications 2025：robust multiplex-DIA workflow

给出 GroupQ / MinQ / MaxQ / ChannelQ、channel-specific filtering、minimum log2 precursor quantity 以及 turnover 应用的完整实现。

打开文献