附录作为独立课程的理由
Spectronaut 的大量提取逻辑、图谱判读和参数影响都集中在附录里。跳过附录，就很容易只记操作路径，而缺少判断框架。
Spectronaut Appendix
Spectronaut Appendix / 参数与图谱判读
本页把附录部分拆成一条独立的附录课程线，覆盖
DIA Analysis Settings、Pulsar Search Settings、
directDIA Settings、Library Generation Settings、
Analysis Perspective Plots、Experiment Tab Options 和
Post Analysis Plots。重点是把附录从“参数表”转成真正帮助建立判断的学习材料。
附录 1-7 独立课程化
参数不是表单而是决策语言
图谱判读专项训练
适合进阶学习与上机复盘
Orientation
附录的角色与重点内容
最密集的设置和图谱说明被集中放进附录，是因为这些内容更适合在已经理解主流程之后再系统学习。附录因此承担进阶课程的角色。
附录的两条主线
附录分为两条主线：第一条是参数线，回答“软件如何决定提取、打分和定量”；第二条是图谱线，回答“结果为何可信以及哪里可能有问题”。
Appendix 知识地图
从参数附录到图谱附录，再到报表字段与 XIC 的学习衔接。
Appendix 1
DIA Analysis Settings
Appendix 1 从 XIC 提取、离子淌度、质量误差容忍度、normalization、cross-run quantity、FDR 到 protein inference，完整说明软件如何提取峰并计入最终定量。
XIC Extraction 的重点内容
Dynamic、Static、Full 三种提取窗口不是“哪个更高级”，而是对可变性和搜索范围的不同取舍。默认 dynamic 的核心，是让软件根据 calibration 自适应窗口宽度。窗口越宽，不一定越安全，反而可能引入更多干扰。
Mass Tolerance 是提取和打分的边界条件
Dynamic tolerance 表示由 Spectronaut 根据校准结果自动决定；Relative 和 Static 则意味着人为更强的约束。mass tolerance 的意义不是“调大就更容易识别”，而是在灵敏度与特异性之间找到平衡。
Appendix 1 与后分析质量
因为 normalization、cross-run quantity 和 protein inference 并不只是分析后处理，而是从一开始就影响结果矩阵如何被构建。它们决定了 data completeness、CV、fold change 和 differential abundance 的上限。
FDR、thresholds 与 protein inference 属于同一条规则链
在这一组设置里，identification threshold、quantification threshold、precursor 层 q-value、protein inference 与 single-hit protein 处理不是分散的按钮。它们共同决定哪些信号可以进入对象集合、哪些对象可以进入定量矩阵、以及蛋白层结果最终能否稳定交付。对 discovery DIA 来说，precursor 层控制得越细，越需要在蛋白层同步说明 inference 与汇总边界。
| 设置点 | 直接改变什么 | 放宽或改变后最容易出现的后果 |
|---|---|---|
| Identification threshold | 哪些 precursor 可以进入已识别对象集合 | target / decoy 分离尚未站稳时，后续所有对象层都被放大 |
| Quantification threshold | 哪些 precursor 可进入定量矩阵 | 矩阵 completeness 看似更高，但低质量读数会抬高 CV 与噪声 |
| Protein inference | 哪些 peptide / precursor 被汇总进 protein group | 同名蛋白组在不同项目间失去可比性，蛋白层名录随规则变化 |
| Single-hit protein | 单条证据支持的蛋白是否保留 | 蛋白层数量上升，但经验错误比例和交付边界同步变宽 |
Appendix 1 学习要点
- 提取窗口、质量误差、FDR、normalization 和 protein inference 应按同一条信号处理链理解，而不是拆成零散开关。
- Ion Mobility 与 RT extraction 一起构成 4D 提取边界，决定软件如何在复杂背景下保留特异性。
- 所有设置最终都要回到图谱证据、completeness、CV 和差异矩阵质量上验证。
Appendix 1 的提取与定量逻辑
- workflow、identification threshold、quantification threshold、XIC extraction、mass tolerance、ion mobility、normalization、cross-run quantity 与 protein inference 共同组成从信号到结果矩阵的规则链。
- XIC extraction 的 Dynamic / Static / Full 决定每个 assay 允许软件在多大范围内寻找峰；mass tolerance 则为这一步再加一层特异性边界，两者必须同时读。
- Ion mobility 设置说明提取空间已经从 m/z 与 RT 扩展到 4D 约束，因此后续 ion mobility overview、PDM 与 XIC alignment 才能真正读懂。
- Normalization、cross-run quantity、FDR 与 protein inference 放在同一节，说明差异分析的上限从 settings 层就已经写进结果矩阵，而不是等到 candidates table 才开始。
蛋白层风险在这一层的写入方式
precursor 层一旦允许更多对象进入，蛋白层的风险不会自动保持不变。protein inference 会重新组织 shared peptides 与支持证据，single-hit protein 则会决定单条证据是否直接进入 protein group。也就是说，蛋白层结果的大小与稳定性不是报表阶段才决定，而是在 Appendix 1 这一层已经被部分写入。
如果数据库同时引入 canonical 与 non-canonical FASTA，或 workflow 进入 peptidomics、开放修饰和更宽的 search space，蛋白层压力会进一步上升。此时最稳的做法不是只盯 precursor q-value，而是同步固定 database 版本、group 结构、protein inference 规则和 single-hit protein 策略。
Appendix 2-4
Pulsar、directDIA 与 Library Generation
这三个附录经常被分开看，但从学习角度更好的方法是把它们视为一组：Pulsar 决定搜索空间和建库逻辑，directDIA 决定 library-free 的分析逻辑，Library Generation Settings 则决定 project-specific library 如何被构建和复用。
Appendix 2：Pulsar Search Settings
这部分需要重点强调酶切、修饰、search mode 和过滤策略如何共同决定 Search Archive 的内容。这里不应被孤立成“建库参数”，而应视为后续所有 library 质量的上游来源。
Appendix 3：directDIA Settings
directDIA 的核心不是“没有 library”，而是“由 raw + FASTA 自己生成项目知识库”。因此它的 settings 应和 Pulsar search settings 对照着讲，帮助新人建立“两步式”分析理解。
Appendix 4：Library Generation Settings
这一附录决定 library generation 过程中的 protein inference、library-wide FDR、QC kit 派生能力和 GO 相关信息。它可与 Library Perspective 一起复盘。
搜索空间一旦扩展，FDR 也要同步升级
Pulsar、directDIA 与 Library Generation 共同决定 search space 的大小和结构。canonical FASTA、non-canonical FASTA、开放修饰、unspecific 搜索或 PTM probing 一旦把候选空间推得更开，错误发现控制就不能只停在统一阈值，而要进一步进入 precursor 层与分组层控制。SP20 的 global precursor FDR 与 precursor FDR per group，正是在这一段开始真正产生价值。
| 数据库 / workflow 结构 | search space 会怎么变化 | 最该同步固定的规则 |
|---|---|---|
| Canonical FASTA + library-based DIA | 候选空间最稳定，group 结构较容易保持一致 | 固定 precursor threshold、protein inference 与常规 single-hit 策略 |
| Canonical + non-canonical FASTA | 前体候选和蛋白分组明显增加，shared evidence 更复杂 | 启用 per-group precursor FDR，并写清 group 结构与蛋白层汇总方式 |
| directDIA + open / unspecific / PTM probing | 项目内自建知识库，候选空间更开放 | 同时固定 database 版本、search mode、protein inference 与 single-hit protein |
Appendix 2-4 的并行阅读结构
- Appendix 2 负责定义 Pulsar search space，例如酶切、修饰、搜索模式和过滤；Appendix 3 把相似的问题迁移到 directDIA，两者共同解释 library-based 与 library-free 的差异。
- Appendix 4 则进一步回答：即便搜索已经完成，project-specific library 还要经过哪些规则去被生成、过滤和沉淀为长期文件。
- 更稳的顺序是先对照它们如何分别控制 search space、identification confidence 和 library quality，再回到主流程页理解 workflow 选择与交付边界。
non-canonical FASTA 场景里的规则联动
当项目把数据库从 canonical 扩展到 canonical + non-canonical 时，软件层面至少有四个地方必须同步改写：precursor 层错误发现控制、group 结构、protein inference 汇总方式，以及 single-hit protein 的保留策略。只要其中任意一项继续沿用旧项目设置，蛋白层名录和经验错误比例就可能失真。
SP20 的 global precursor FDR 与 precursor FDR per group 需要和 protein-level 规则一起阅读。前者解决更开放搜索空间下 precursor 层的稳健控制，后者决定这些 precursor 如何进入最终的蛋白层交付对象。
Appendix 5
Analysis Perspective Plots
Appendix 5 是最像“读图教科书”的部分。从 iRT calibration 到 PDM，再到 XIC alignment 和 protein coverage，这些图共同构成了 Analysis review 的证据体系。
怎么用这些图建立读图直觉
不需要一开始就把二十多张图全部看完。更稳的节奏是先理解 iRT calibration、identifications per cycle、PDM 和 XIC alignment 这四类，它们最容易帮助建立“好图”和“坏图”的直觉。
附录图与方法优化
Ion mobility overview、DIA acquisition method overview、precursor vs protein quantities 这些图，已经提供 acquisition method 优化和验证的窗口，因此它们不只是分析后复核工具，也能进入方法开发学习。
按 Appendix 5 顺序展开：Analysis plots 可以分成哪几类来学
- 第一类是 calibration 与 acquisition plots，例如 iRT calibration、identifications per cycle、ion mobility overview，它们帮助你判断方法是否采到了足够可解释的信号。
- 第二类是 peak-centric plots，例如 XIC、PDM、MS1 / MS2 spectra、mass error 和 XIC alignment。这一类是 manual review、fragment selection 和峰界判断的主战场。
- 第三类是 cross-run plots，例如 precursor / protein quantities、run identifications 和 data completeness，它们把单一 run 的峰级证据推进到多 run 的矩阵质量判断。
- 附录中的每一种图都对应一类问题，而不是把所有 plot 混成一张“软件自带图册”。
Appendix 6
Experiment Tab Options
这部分容易被低估，但它非常适合作为上机实操课。accept、reject、hide、exclude、pending changes 这些操作会分别改变对象状态、显示结构和后续结果。
Manual Review 的边界
实验 tab 里的手动操作不是“随便改一改图”，它们会改变 review 状态、可见性乃至定量输入。这里应始终结合 `IsUserPeak`、`IsVerified` 这类字段一起理解，避免 GUI 操作和报表输出脱节。
Experiment Tab 与排错入口
当样本异常、峰界可疑、某一批次整体偏移时，Experiment Tab 是最快的排查入口。因此它不只是“操作说明”，也是交付前最后一层人工把关机制。
按 Appendix 6 顺序展开：哪些动作只是显示变化，哪些动作会触发真正重算
- 像
Save / Save as、Group by、Order Runs By这类更偏组织和浏览；而Process Pending Changes、Refresh Post Analysis、Commit Library Changes则会真正影响分析结果或其解释层。 - 这些动作被集中列出，是为了分清“我是在整理视图”还是“我是在修改结果对象”。这对排错和复盘非常关键。
- 实验 tab options 还提供从 GUI 回到 settings、condition setup 和 summary 的入口，这意味着它是“结果层的返工口”，而不是孤立的右键菜单。
Appendix 7
Post Analysis Plots
从 run identifications、data completeness、CVs below X 到 LFQBench、PCA、volcano、heatmap，Appendix 7 其实已经构成了一整套“结果复核课”。
Appendix 7 学习要点
- 先用 run identifications 和 data completeness 教“整体稳定性”，再用 PCA、volcano 和 heatmap 教“生物学结构”。
- LFQBench 非常适合做平台方法学学习，因为它比单纯的 volcano 更能体现定量体系的偏差与精密度。
- 如果是 PTM 项目，Appendix 7 还应延伸到 PTM analysis plots，让你知道位点级可视化和蛋白级可视化是两套不同逻辑。
按 Appendix 7 顺序展开：结果图最推荐的阅读顺序
- 先看 run identifications、data completeness 和 CVs below X，判断矩阵有没有资格进入差异解释。
- 再看 PCA、volcano 和 heatmap，判断条件结构、异常样本和候选分子是否具有整体一致性。
- 最后才回到 specialized workflow plots，如 LFQBench、pSILAC 或 PTM plots。这样读图，能避免一开始就被“显著结果”带跑偏。
Bridge
附录 1-7 与 Appendix 8-9
更稳的顺序不是一直停在图和参数，而是在理解了参数和图谱之后，进入字段词典和 XIC 数据库接口。这样“如何运行”“如何导出”“如何复核”就能完整接起来。
Reporting 模块
继续学习 Appendix 8 的对象层级字段字典，以及 Appendix 9 的 XIC Export DB。
进入 FDR 专题页
把 precursor 层控制、protein inference、single-hit proteins 与经验错误比例连成一条交付链。
附录图谱入口
如果需要更快查看附录核心 figure，可从软件页的 Appendix 图谱入口直接进入。
附录与 Appendix 8 / 9 的衔接
- 前 7 个附录回答的是软件如何提取、显示和打分；Appendix 8 / 9 则进一步回答这些对象怎样被写进 report，又怎样回连到 XIC 证据层。
- 把这两层接起来之后，图谱、参数、字段、数据库接口与 FDR 才会收束为同一条证据链，蛋白层交付边界也才能真正说清。
Next Steps
附录页的联动技术路径
可按 Analysis 主流程、附录图谱、Reporting / XIC、字段练习与排错四层连续查看，使参数、图谱、字段和交付结构保持一致。
进入 Analysis 课程
把附录参数和 workflow 重新对应起来。
进入 Reporting 课程
继续学习 Appendix 8 / 9 与报表对象层级。
章节结构与索引
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