前体 q-value 0.01；MS1/MS2 质量窗口各 15 ppm；relaxed protein inference；重注释输入库；启用 reanalyse 与 RT/IM profiling；RT-dependent 跨运行归一化；QuantUMS high-precision 定量。
1准备输入
2检查设计
3提交计算
4浏览结果
选择定量报告与 FASTA
先选择实际搜索得到的主报告和搜索时使用的蛋白序列库。后续实验设计、参数和提交区会在可用时依次展开。
从你的当前进度开始
DIA 搜索是否已经完成？
已有最终逐前体报告可直接上传；尚未搜索时，先使用搜索前准备助手整理实验设计、FASTA、谱图库策略和交接文件。
搜索前准备助手
把可在网页完成的准备工作整理好，再到 DIA-NN 或 Spectronaut 执行搜索
本助手不运行搜索引擎，但会帮助确定实验设计、FASTA、谱图库路线和交接文件，减少搜索完成后才发现输入不匹配的情况。
展开论文建库与搜索设置（用于复现或制定方案）
这些数值对应论文的 timsTOF Pro 2 / diaPASEF 数据和软件版本，不是所有仪器的通用默认值。自己的项目应保留相同分析原则，并按实际采集方法校准质量窗口与保留时间设置。
前体 q-value 0.01、前体 PEP 0.20；实验级蛋白 q-value 0.01、单次运行 0.05、蛋白 PEP 0.75；本地回归 RT 对齐、跨运行归一化和 synchronized-window 定量。
半特异胰酶切，肽长 7–52 aa，最多 2 个漏切；Cys 固定氨甲酰甲基化，Met 氧化和蛋白 N 端乙酰化为可变修饰，最多 5 个可变修饰位点；PSM、肽段、蛋白 FDR 均为 1%。
论文三轮聚焦库辅助在浏览器本地读取 DIA-NN TSV，生成下一轮候选文件
本地处理
文件不会上传服务器。助手只执行论文规定的筛选与 FASTA 裁取，不进行谱图预测、峰组识别或 DIA 搜索。
读取完全特异搜索报告，按蛋白组 global q ≤ 0.01 且前体 PEP ≤ 0.01 保留蛋白，再从原始复合 FASTA 裁取匹配序列。
等待第 1 轮报告和 FASTA。
第 1 轮文件沿用左侧选择；再读取半特异第 2 轮报告。两轮均按蛋白组 global q ≤ 0.05 且前体 PEP ≤ 0.05 筛选并按 Precursor.Id 去重。
等待第 1、2 轮报告。
输出边界：聚焦 FASTA 和前体候选 TSV 是下一轮建库/筛选的交接文件，不是 DIA-NN 可直接替代预测谱图库的最终定量报告。完成外部搜索后，仍需上传最终 Main output。
- 01先固定实验设计
确定条件、比较方向和生物学重复；本模块最低要求每个条件 2 个有效重复。样品制备、上机顺序和批次应在搜索前记录。
下载实验设计模板 - 02固定与搜索一致的 FASTA
合并研究物种与污染物序列，保留版本和下载日期；后续 DIA-LiPQuan 必须使用同一份 FASTA 做肽段、切割位点和物种映射。
从本站 UniProt 选择 - 03选择谱图库策略
样本只覆盖参考蛋白组子集时可考虑聚焦预测库；全蛋白组探索优先考虑完整性。DDA、混合、全预测或直接搜索得到的合格最终报告都能进入本模块。
- 04在外部软件完成搜索
DIA-NN 或 Spectronaut 负责谱图预测、峰组识别、FDR 控制和定量。下载的交接清单用于逐项核对设置，不会代替搜索软件。
Spectronaut 最终报告模板 - 05带回最终逐前体报告
保存完整 Main output、实际使用的 FASTA、样品设计和参数记录。不要用蛋白矩阵、肽段矩阵或谱图库文件代替最终逐前体报告。
清单会按上方选择写入论文聚焦库参数、最终应保留的文件和 DIA-LiPQuan 上传要求。
01
项目与输入文件
文件仅用于本次分析；登录后可将通过检查的任务保存为数据集。
论文数据 Demo
文献数据 · DIA-LiPQuan 完整结果模块
采用补充表 S1/S2 的真实定量值和本地 UniProt 复合 FASTA，按原 DIA-LiPQuan 分析路线预计算。点击后立即打开与用户上传任务相同的五类结果和交互图表。
先选择逐前体 DIA 定量主报告
本步骤只判断报告来源和文件。选择完成后，向导才会显示 FASTA。
使用 DIA-NN：主报告怎样选择？
文件名不是硬性判断条件。DIA-NN Main output 常见为 report.tsv、<project>.report.tsv 或 report.parquet；TSV 和 Parquet 可直接上传，也支持单文件 ZIP、GZ 或 TAR 压缩包。
不要选择汇总矩阵或谱库。*.pg_matrix.tsv、*.pr_matrix.tsv、*.unique_genes_matrix.tsv、*-lib.tsv、*.speclib 和 *.quant 不能替代逐前体主报告。
最终以字段检查为准。系统会检查 Run、Q.Value、Lib.PG.Q.Value、Protein.Group、Stripped.Sequence、Modified.Sequence、Precursor.Charge 及定量列。
使用 Spectronaut：先下载模板再导出
模板与导出说明放在同一卡片内。先将模板导入 Spectronaut 的 Report Perspective，再导出制表符分隔的逐前体 TSV，随后在左侧上传。
下载 Spectronaut 报告模板推荐文件名：<project>-DIA-LiPQuan-report.tsv。文件名只帮助识别，不参与报告类型判断；不要上传 PDF、Excel 汇总表、Pivot Report 或谱库文件。
允许保留更多列。Gene、Protein Description、Qvalue、RT、m/z 等额外字段不会阻止检查。
再选择本次搜索实际使用的 FASTA
肽段、切割位点和物种映射都依赖这份序列库，因此应尽量与搜索时使用的 FASTA 保持一致。
FASTA
蛋白序列库
每个压缩包只放一个 FASTA、FA 或 FAA 文件
尚未选择 FASTA
最后确认实验设计
实验设计不是可省略的数据。“设计表可选”仅表示无需必须上传文件：内置编辑器可以从未压缩 TSV 识别样品并生成同一份设计。
适用于未压缩的 DIA-NN 或 Spectronaut TSV。系统读取 Run 或 R.FileName，只需确认 condition 与 replicate。
适用于 Parquet、压缩报告，或已经准备好分组表的项目。模板和上传入口均在本卡片内。
尚未读取实验设计
在线实验设计
检查样品、条件和生物学重复
自动识别与上传文件都会进入同一个编辑器；修改后的表格将作为本次分析实际使用的设计。
未压缩 TSV 可自动识别；Parquet 或压缩报告请使用同卡片内的设计表上传入口。
| 样品 | 条件 | 生物学重复 | 操作 |
|---|
只有设计通过检查后，组间比较和统计参数才会解锁。
✓
三类输入已经就绪
后续只显示当前需要处理的组间比较、参数与提交。需要更换文件时可从这里返回对应步骤。
02
组间比较
每个条件至少 2 个生物学重复。比较方向为“处理组 vs 对照组”。
上传实验设计表后显示条件
VS
尚未设置组间比较
03
统计参数
默认参数来自当前 DIA-LiPQuan 配置；论文基准中的阈值会在介绍页单独说明。
DIA-NN Q.Value < 0.01Lib.PG.Q.Value < 0.01
定量值 > 1.1K/R 作为限制性位点参照每组至少 2 个重复
上传、检查并提交
大文件采用分片上传。服务会先核对字段、样本名、重复数和比较组合，通过后才允许进入计算。
输入识别
等待上传并检查
通过检查后，将在这里显示报告字段、样品映射和可分析数据概况。
字段兼容性
样品识别
任务结果
选择一个任务查看结果
完成上传后，任务进度与结果将在这里显示。
尚未选择任务
请先载入 Demo，或在“新建分析”中上传文件并完成输入检查。
准备输入
输入检查
计算
结果就绪
数据来源已核验
文献补充表 S1/S2 · DOI 10.1021/acs.analchem.6c02411
Demo 使用补充表真实定量值、本地 UniProt 复合 FASTA，并按原 DIA-LiPQuan 路线预计算。
正式分析管线
本地 UniProt FASTA
01 · 全分析概览
从鉴定深度到定量与差异结果
先查看同一任务跨物种、条件和掺比的总体结果，再进入下方结果层级深度浏览，追踪肽段、切割位点或蛋白证据。
全局图形设置 统一作用于全分析概览和下方当前结果层级图表
仅改变显示样式，不改变分析参数、统计结果、作图数据或下载结果表。
Figure 2 / Figure S1
LiP 蛋白组鉴定深度
人源按 Figure 2 展示全实验、H2、H5、H7.5、H30；酵母按 Figure S1 额外保留 H0。完全特异肽段、半特异肽段和蛋白组均统一使用 DIA-NN DDALib 论文蓝色。
Figure 3A · 1
各掺比可定量肽段数
比较顺序固定为 H2/H5、H7.5/H5、H30/H5；肽段类型顺序与论文 Figure 3A 一致。
Figure 3A · 2
各掺比 log2 定量比值分布
箱体、须线、中位数和 IQR 均由完整肽段结果计算；文献数据 Demo 叠加论文预期比值虚线，用户数据不预设生物学期望。
单管线差异结果
差异条目分层汇总
仅展示当前 DIA-NN DDALib 方法，不混合其他工作流；蛋白层级要求同一蛋白至少 2 条肽段证据通过当前阈值。
QC
组内肽段定量 CV
这是软件补充的质量控制视图，不冒充论文图；仅纳入同一条件至少 3 个有效重复的肽段。
结果层级深度浏览
从总体趋势进入可追溯证据
交互结果总览与上方图形来自同一分析任务。左侧切换结果层级，右侧图表、作图数据和明细表共同解释对应的肽段、切割位点或蛋白证据。
- 1查看概览
- 2选择层级
- 3追踪证据
当前结果层级分析
差异结果
图表来自当前完整结果表；点数较多时只对散点进行可复现抽样，汇总统计和分箱仍使用完整表。
01
效应与统计显著性
火山图比较
每次仅显示一个掺比；切换不会合并不同比较的数据点。
横轴为 log2FC，纵轴为所选 p 值的 −log10；缩放或框选查看密集区域，点击数据点可联动明细表。
02
差异方向构成
计数来自完整结果表。点击扇区可筛选下方结果明细。
03
log2FC 分布
全部可计算条目按效应量区间汇总，用于判断总体偏移与长尾。
04
效应量排序
按 |log2FC| 展示当前层级的高效应条目；点击条目可在明细表中定位。
可追溯结果明细
结果表
搜索、排序、方向筛选与列设置只改变浏览视图，不改变计算结果。
D
长期数据集
登录后可跨浏览器浏览已保存任务，复用相同输入重新计算，避免反复上传大文件。
登录后显示长期保存的数据集。
先回答最重要的问题
它帮助你从复杂的 DIA 报告里，找出可能发生局部构象变化的蛋白区域
DIA-LiPQuan 面向 LiP-MS 实验。你提供 DIA-NN 或 Spectronaut 定量报告、搜索使用的 FASTA 和实验分组，系统会把分散在报告中的信号整理成肽段、非限制性切割位点和蛋白三个层级的可追溯证据。
你提供DIA 定量报告每个样品的前体或肽段定量
→
系统完成检查、汇总与统计沿用 DIA-LiPQuan 分析路线
→
你获得可定位的变化证据图表、作图数据和结果明细
研究药物作用、环境变化、疾病状态或蛋白互作是否伴随局部蛋白酶可及性变化。
显著肽段是候选构象证据，不等于已经确定三维结构；仍需结合蛋白总量、结构域和正交实验。
LiP-MS 背景与测量对象
LiP-MS 测量的是天然蛋白环境中“局部蛋白酶可及性”的变化，而不是直接拍摄三维结构
LiP 是 limited proteolysis（限制性蛋白水解）的缩写。蛋白在溶液中并非一张静止结构图，而是由折叠状态、配体结合、蛋白复合物、翻译后修饰和局部柔性共同形成的构象集合。短时 Proteinase K 处理会优先切开更容易接近的区域；不同条件产生的切割端点和肽段丰度差异，随后由 LC-DIA-MS 读取。
在非变性条件下尽量保留蛋白折叠、配体和复合物环境。这里的“结构”包含构象集合与相互作用状态，不只是单一静态模型。
低酶量、短时间的 Proteinase K 处理把局部可及性编码为新的非胰蛋白酶切割端点；更暴露不一定意味着整条蛋白都展开。
随后在变性条件下用 Lys-C/trypsin 完全酶解，生成可被 LC-MS 测量的完全特异和半特异肽段，并在全部重复间定量。
统计比较的是处理与对照的肽段强度和切割位点证据。显著变化提示局部可及性改变，仍需排除蛋白总量、缺失值和技术变异。
论文原图 · Figure 1先看 b 理解 LiP-Quant 原理，再用 a、c、d 理解为什么不能只看一次火山图
- 先看 b：结构怎样变成信号
游离与配体结合状态对 PK 的暴露不同；药物浓度逐级增加后，真正与结合相关的肽段应呈连续剂量响应。
- 再看 a：单剂量为什么会有候选过多
已知靶标 FKBP1A 被标出，但火山图上还有其他显著点，说明单次差异不能自动等同于直接靶点。
- 再看 c：评分用于优先级排序
已知靶标肽段的分数分布整体向高分侧移动；阈值用于富集可信候选，而不是给出绝对结构证明。
- 最后看 d：重复的浓度趋势最有解释力
FKBP1A 的高排名肽段呈可拟合的上升或下降曲线，支持同一蛋白的多肽段、方向和剂量证据共同判断。
这些事件都可能改变 PK 可达性，所以“显著 LiP 肽段”首先是局部状态变化证据。
同一肽段强度变化并不总由构象引起；结果解释必须回到样品级定量、位点和蛋白层级。
- 1比较两种或多种状态例如处理组与对照组；每组需要足够的生物学重复。
- 2进行有限蛋白酶解较短反应保留与局部可及性相关的切割差异。
- 3常规酶解并用 DIA 定量完全特异肽段和半特异肽段共同进入搜索与定量报告。
- 4把变化映射回序列非 K/R 端点可形成非限制性切割位点证据。
理解结果时记住：
肽段丰度变化可能来自局部可及性，也可能受到蛋白总量、缺失值和重复覆盖影响。因此结果必须分层查看，不能只看一张火山图。
核心研究 · Analytical Chemistry 2026
LiPQuan 把逐前体定量报告转换为肽段、PK 切割位点和蛋白三级证据，并固定会改变结论的统计规则
该研究比较七种 DIA LiP-MS 搜索工作流，并用组成和比例已知的混合蛋白组评价鉴定错误、定量偏差、真阳性率和假阳性率。DIA-LiPQuan 位于 DIA-NN 或 Spectronaut 搜索之后，为不同搜索结果执行统一的肽段、切割位点和蛋白层级统计。
核心研究论文
阅读论文原文
Evaluating DIA LiP-MS Analysis Workflows with a Hybrid LiP Proteome Benchmark
Analytical Chemistry · 2026 · DIA LiP-MS 方法与基准研究
文献关系：Piazza 等发表于 Nature Communications 的 2020 年研究建立了 LiP-Quant 的剂量响应与靶点优先级框架；2026 年 Analytical Chemistry 研究进一步评价 DIA LiP-MS 搜索工作流，并以 DIA-LiPQuan 统一处理搜索后的定量与统计。
系统评价谱图库策略、搜索软件、定量准确性和差异检出表现，而不是只比较鉴定数量。
变化的人源组分提供真阳性参照，恒定的酵母背景和 H0 条件提供误报参照。
接收 DIA-NN 或 Spectronaut 主报告，完成过滤、MaxLFQ、缺失值处理、差异统计、位点映射和蛋白证据合并。
LiPQuan 需要控制的四个分析风险
大量半特异肽段显著扩大候选空间；DIA 的共分离和共碎裂又增加谱图复杂度，常规蛋白级 FDR 不能代替肽段级检查。
某个流程鉴定更多肽段，并不代表这些肽段的比例更接近真实掺比，也不代表差异结果更少误报。
只看 p 值、加入不同变化倍数阈值，或用不同规则把肽段合并到位点和蛋白，都可能得到不同候选清单。
只有处理组和对照组的生物数据无法直接知道哪些变化是真阳性、哪些是误报，因此也难以比较灵敏度和特异性。
这项研究的重要突破
在上述混合蛋白组基准论文中，作者把“应该变化”的人源蛋白和“应该不变”的酵母蛋白放入同一套 DIA LiP-MS 数据，使鉴定深度、定量误差、真阳性率和假阳性率能够依据已知真值直接评价。DIA-LiPQuan 则为不同搜索结果提供统一的下游定量和统计口径，使工作流间比较落在同一证据标准上。
已知真值 · 正文 Figure 1
人源膜蛋白按 5 个比例加入，酵母蛋白保持不变；同一数据同时给出真阳性和假阳性参照
研究设置 H0、H2、H5、H7.5 和 H30 五种混合物，每组 4 个独立重复，共 20 个 diaPASEF 运行。H5 作为共同参照，人源肽段应随掺入比例变化，酵母肽段在所有比较中都应保持 1 倍。
论文原图 · Figure 1Figure 1A 把样品组成、20 次 DIA 运行、外部搜索和 DIA-LiPQuan 的位置放在同一条流程线上
- 先看 A 左下：五个掺比必须按 H0、H2、H5、H7.5、H30 理解
每个条件 4 个独立重复。H5 是共同参照；人源组分改变，酵母背景保持恒定。
- 再看 A 中部：20 个 diaPASEF 运行形成可比较的定量矩阵
同一组样品进入 Spectronaut 或 DIA-NN 搜索，最终逐前体主报告才是 DIA-LiPQuan 的输入。
- 最后看 A 右侧：DIA-LiPQuan 位于搜索之后
它不替代 DIA-NN 或 Spectronaut，而是完成结果过滤、肽段定量、差异统计、切割位点和蛋白证据汇总。
- H0 只用于鉴定误差参照，不进入 H2/H5、H7.5/H5、H30/H5 定量比较
这样才能把“理论不应出现的人源鉴定”和“已知幅度的真实变化”分开评价。
用于计算比值偏差、真阳性率和 ROC；H7.5/H5 的 1.5 倍弱变化尤其考验灵敏度。
被判为差异的酵母条目可用于观察假阳性；补充 Figure S2 专门展示了这部分定量和 ROC。
用于 entrapment 式 FDP 上界估计；论文同时提醒该估计依赖物种和数据库假设，不能机械等同于真实 FDR。
证据位置：正文 Figure 1 与方法部分；补充 Figure S1–S2 提供酵母鉴定和定量对照。
鉴定与谱图库 · 正文 Figure 2，补充 Figure S1
七种 DIA 工作流用于区分谱图库策略、搜索软件和样本组成对鉴定结果的影响
DIA-NN 与 Spectronaut 分别结合 DDA、混合、全蛋白组预测、聚焦预测或 directDIA 策略。全蛋白组预测库包含约 3,060 万条 LiP 肽段，远大于实验库；聚焦预测库缩小到约 9.66 万条肽段，用更接近项目组成的搜索空间换取效率和稳定性。
聚焦预测库接近实验库的鉴定深度
相较全蛋白组预测库，聚焦库在人源完全特异肽段、半特异肽段和蛋白鉴定上均有提升，说明预测库也需要与样本组成匹配。
大多数流程的肽段 FDP 上界接近或低于 1.3%
但 DIA-NN 混合库流程略高；半特异肽段并未普遍表现出不可接受的错误率，不能因其搜索更难就全部舍弃。
鉴定覆盖受样本比例影响
某种流程在高掺比中鉴定更多，不保证在低掺比或真实项目中同样占优，因此论文继续用比例准确性和误报来评价。
论文原图 · Figure 2前三排看鉴定覆盖，最下排 D 才回答错误发现比例是否受控
- A：完全特异肽段
先比较全实验和 H2、H5、H7.5、H30 各条件的鉴定数量；浅蓝柱高并不自动代表定量更准确。
- B：半特异肽段是 LiP-MS 的关键信号
不同谱图库策略对这一层影响尤其明显，因为半特异候选空间远大于常规完全特异搜索。
- C：蛋白组数量是覆盖结果，不是结构结论
蛋白数用于描述搜索深度，后续仍需肽段定量、切割位点和多肽段证据。
- D：FDP 越低越好，但必须结合覆盖度
论文用 H0 中理论不应出现的人源条目估计 FDP 上界，同时提供标准胰酶对照；不能只按柱子最高的工作流做选择。
实操教程 · 论文 Methods：Focused Predicted Library Generation
聚焦预测库在 DIA-NN 搜索阶段通过三轮筛选构建，完成后才进入 DIA-LiPQuan
它适合膜蛋白、细胞器、亲和富集等“实际样本只覆盖参考蛋白组一部分”的项目。核心思想是先用完全特异肽段找出样本中可信存在的蛋白，再只为这些蛋白扩展半特异肽段候选，最后把两轮可信前体合并成项目专用预测库。
例如膜蛋白富集、细胞器组分或靶向富集；缩小候选空间有助于控制半特异搜索的规模。
聚焦库以项目特异性换取较小搜索空间，不是更完整的库；首轮未保留的蛋白不会进入后续半特异候选。
论文原图 · Figure 1D聚焦库的三轮关系就在 Figure 1D：完全特异首轮、半特异二轮、合并前体后的最终搜索
- 左起第 1 个文件：完全特异预测库
用它搜索全部 DIA 运行，得到 Report 1，并以可信蛋白组缩小真实样本可能包含的蛋白范围。
- 中间文件：只为首轮蛋白生成半特异候选
第二次搜索得到 Report 2。这个步骤控制 LiP 半特异搜索空间，而不是在下游结果页再勾选一次。
- 底部绿色文件：最终聚焦预测库
合并两轮通过筛选的完全特异与半特异前体，再执行最终定量搜索。
- DIA-LiPQuan 接收最终 Main output
本网页不会代替 DIA-NN 完成三轮建库；用户应同时保留最终 report.tsv、实际 FASTA、软件版本和阈值记录。
-
准备
固定同一份复合 FASTA 和搜索参数
论文将人源、酵母和污染物 FASTA 合并。理论前体分别按完全胰蛋白酶特异性（最多 2 个漏切）和半特异性（最多 1 个漏切）生成；长度 7–33 aa、电荷 2+/3+、Cys 固定氨甲酰甲基化，并保留蛋白 N 端甲硫氨酸与乙酰化变体。
-
第 1 轮
只用完全特异肽段预测库搜索全部 DIA 运行
这一步用于识别样本中可信存在的蛋白，不直接把巨大的半特异候选空间全部加入。保持最终搜索计划使用的原始文件、FASTA 和质量控制设置不变。
-
第 2 轮
按蛋白组 global q ≤ 0.01 且前体 PEP ≤ 0.01 保留蛋白
仅为这些蛋白生成半特异肽段预测库，再次搜索 DIA 数据以识别 LiP 相关半特异前体。此处的 q/PEP 是论文用于缩小谱图库的筛选条件，不是下游差异分析的 p 值。
-
第 3 轮
合并前两轮前体，生成最终聚焦预测库并完成搜索
论文将第 1、2 轮识别的前体合并，再按蛋白组 global q ≤ 0.05 且前体 PEP ≤ 0.05 筛选，形成同时包含完全特异和半特异条目的聚焦库。随后用该库执行最终 DIA-NN 定量搜索。
搜索软件中完成三轮建库与最终 DIA-NN 搜索
→
保存最终逐前体 Main output，并记录使用的复合 FASTA、DIA-NN 版本和各轮阈值。
DIA-LiPQuan 输入上传最终 report.tsv 与同一份 FASTA
不要上传预测谱图库代替定量报告。DIA-LiPQuan 执行样品设计检查、定量汇总、差异统计、切割位点和蛋白证据分析。
没有聚焦库也可以使用本模块
DDA 库、混合库、全蛋白组预测库或其他合格搜索得到的逐前体报告都可进入下游分析。聚焦库是论文推荐的项目特异搜索策略之一，不是提交 DIA-LiPQuan 的强制前置条件；当前网页不会在上传后反向重建谱图库。
操作依据：论文 Methods 的 Whole-Proteome Predicted Library and Focused Predicted Library Generation。不同 DIA-NN 版本的按钮位置可能变化，但三轮输入、筛选对象和阈值应保持可追溯。
定量与差异检出 · 正文 Figure 3，补充 Figure S2
定量评价必须同时检查理论比值偏差、真阳性率和酵母假阳性率
DIA-NN 多种流程的中位比例更接近理论值，整体相对误差低于 12.7%；部分 Spectronaut 流程虽然定量覆盖更高，但在低掺比比较中偏差和离散度更大。补充 Figure S2 用理论上不变的酵母肽段证明，只比较人源“命中数”会遗漏误报问题。
论文原图 · Figure 3A 读定量偏差，B 读不同阈值下的人源真阳性与酵母假阳性
- A 的三大横排依次是 H2/H5、H7.5/H5、H30/H5
红色虚线是真实掺比的 log2 期望值；箱体中位数越接近虚线，系统比例偏差越小。
- A 的每一列把肽段类型拆开
All、fully tryptic、semi-tryptic、K/R 端和 non-K/R 端不能混成一个数字；LiP 解释尤其关注半特异端点。
- B 上排是人源真阳性，下排是酵母假阳性
同一阈值必须同时观察两排，避免只以检出数量评价流程。
- H7.5/H5 是最敏感的弱变化检验
理论 FC 只有 1.5。把 FC 提到 2 会必然丢失大量真实变化，因此“更严格”不等于更准确。
同时要求 BH 校正 p < 0.05。不同阈值用于基准比较，不应与网页的 log2FC 输入直接混写。
不同掺比和流程差异明显；H7.5/H5 只有 1.5 倍，是最容易被严格阈值漏掉的弱变化。
只用 p 值时上升到 5.00%–5.74%，说明效应量与多重检验需要共同考虑。
阈值收紧对弱效应检出的影响
在 H7.5/H5 中，把 p 阈值收紧到 0.01 或把变化倍数提高到 2，会显著降低对真实弱变化的检出；在部分位点分析中，真阳性下降的同时假阳性比例还会升高。阈值需要根据目标效应、重复数和错误控制共同选择，而不是越大越好。
证据位置：正文 Figure 3；补充 Figure S2 展示酵母定量分布和 ROC，作为“应该不变”的误报参照。
证据汇总与生物学验证 · 正文 Figure 4–6，补充 Figure S3
从肽段到切割位点再到蛋白，每一次汇总都在重新平衡灵敏度和特异性
论文比较了最小 p 值、多数规则和“全部肽段 MaxLFQ 后再统计”三种切割位点策略。全部肽段策略保持相近真阳性率，同时给出最低的酵母假阳性率。蛋白层面只要求 1 条差异肽段灵敏度高，但假阳性率达到 11.25%–13.04%；要求至少 2 条肽段后，假阳性率降至 2.20%–6.39%，代价是部分灵敏度。
论文原图 · Figure 4A–B 比较切割位点汇总，C–D 比较一条与两条肽段定义蛋白时的取舍
- A：同一切割位点有三种汇总办法
minimum p-value、majority rule 和 all-peptide 的人源真阳性相近；酵母假阳性可用于判断哪种规则更稳健。
- B：论文选择 all-peptide 后再比较三种 DIA-NN 工作流
这一层回答的是“同一 PK 端点如何汇总”，不是再次进行谱图搜索。
- C：一条肽段定义蛋白很敏感，但误报明显较高
酵母假阳性在一肽段规则下达到约 9%–13%；两条肽段支持显著降低误报。
- D：两条肽段规则牺牲部分真阳性以换取特异性
DIA-LiPQuan 默认采用多肽段蛋白证据，同时保留全部肽段和位点明细供用户复查。
查看论文 Figure 5–6：这些图怎样验证 LiPQuan 结果，而不是新增一套软件输出
Figure 5–6 来源同上。它们是独立生物学数据的再分析和方法验证；本模块对用户上传数据提供相同的肽段、位点、蛋白和剂量趋势基础结果，但不会假定每个项目都具有 GPCR 蛇形图或已知激酶真值。
先检查重复覆盖、缺失和变化方向，避免单个异常值直接进入生物学结论。
不应只挑最小 p 值；同位点全部肽段可减少选择性报告带来的误报。
论文比较了一肽段与二肽段规则的不同取舍，本模块默认采用偏重特异性的双肽段证据。
在 NECA 和 G 蛋白状态数据中，预测库流程识别到更多差异切割位点，并覆盖 DRY motif、ECL2/TM5 等与受体状态相关的区域。
Staurosporine 数据表明，聚焦预测库配合多肽段或剂量响应证据，可提高已知激酶靶点覆盖并减少非激酶候选负担。
Figure 5–6 是对优化搜索与 DIA-LiPQuan 分析价值的生物学验证案例；当前 Demo 重点复现本程序直接计算的定量、差异、位点和蛋白结果，不把这些独立生物实验当作用户任务的必然输出。
方法必要性与适用边界
DIA-LiPQuan 的质量控制覆盖从逐前体报告到候选蛋白的每一层证据
如果直接套用常规差异蛋白流程或临时电子表格，半特异肽段、切割位点、重复覆盖和蛋白证据很容易被简化掉。DIA-LiPQuan 的价值，是把这些会改变结论的规则固定在一条可复查的分析链中。
容易被忽略的步骤可能造成的问题DIA-LiPQuan 的控制
把前体直接当成独立证据同一肽段重复计数，样品间不可比按前体、肽段、位点和蛋白分层汇总
缺失值和重复覆盖未统一人为放大 fold change，或让少数样品决定结果明确有效重复、缺失分类与可追溯明细
只挑最小 p 值的肽段位点与蛋白误报增加，候选难以复现保留同位点肽段并采用一致的汇总规则
只看 p 值或只提高 FC 阈值误报升高，或漏掉真实弱变化同时报告效应量、多重校正和阈值敏感性
一条肽段直接定义蛋白论文基准中的蛋白假阳性明显升高默认至少两条合格肽段支持蛋白结论
不是只有一种有效做法
经过充分验证的自建流程也可以得到可靠结果，但必须同样处理输入过滤、半特异肽段、重复覆盖、缺失值、多重检验、位点汇总、蛋白证据和分析记录。风险来自省略这些控制，而不是来自没有使用某个品牌或网页。
论文和工具仍有边界
- 基准中的人源组分是膜蛋白富集样本，不代表所有蛋白和所有仪器条件。
- 全蛋白组预测库的表现受超大搜索空间及样本组成不匹配影响，聚焦库也不是所有项目都必然更好。
- entrapment FDP 依赖数据库和物种假设；显著 LiP 肽段只提示可及性或构象候选，不能单独证明三维结构或直接药物靶点。
开始分析前
准备定量报告、搜索所用 FASTA 和实验设计；比较组合可在网页中设置
文件名用于帮助你辨认文件，系统最终依据列标题和数据内容判断是否合格。报告可以包含更多附加列，不会因为多列而被拒绝。
与论文流程的位置对应
回看 Figure 1A 最右侧：DIA-LiPQuan 从 DIA-NN 或 Spectronaut 的逐前体主报告开始。FASTA 用于把肽段映射回蛋白序列，实验设计用于把报告中的 run 归入 condition 和 replicate；三者通过验证后，网页才开放比较和统计参数。
DIA-NN 使用逐前体 Main output，常见名称为 report.tsv、<project>.report.tsv 或 report.parquet。不要用 pg_matrix、pr_matrix、谱库或 .quant 文件替代。
优先上传搜索时实际使用的完整蛋白序列库。也可从本站 UniProt 模块按物种或 Proteome 选择并自动带回。
从 UniProt 选择 FASTA需要 run、condition、replicate 三项信息。可以上传三列表，也可以从未压缩的 DIA-NN 或 Spectronaut TSV 自动识别样品后在线编辑。
实验设计模板明确处理组与对照组方向。软件默认阈值来自当前 DIA-LiPQuan 配置；论文基准评价使用的 fold-change 规则需按研究目的另行选择。
Spectronaut 报告需要哪些内容？
请在 Report Perspective 中使用提供的模板导出制表符分隔的逐前体 TSV。核心字段包括样品、蛋白组、肽段、修饰肽段、电荷和 MS1/MS2 定量列；Gene、描述、RT、m/z 等额外列可以保留。
下载本段所述 Spectronaut 模板方法与结果判断
保留原 DIA-LiPQuan 算法路线，并让每一步都能回到证据表复查
网页计算保留原流程的输入过滤、MaxLFQ 汇总、缺失值处理、经验贝叶斯差异检验、BH 校正、切割位点映射和蛋白证据规则。Python 仅替代服务器上的 R 运行环境，不另设一套简化算法。
用于评价不同流程的真阳性率和假阳性率；论文还比较了更严格的 p 值和变化倍数条件。
沿用所集成 DIA-LiPQuan 源程序的参数语义。两种写法不可直接视为同一阈值；用户修改参数后会按新设置重新计算。
DIA-NN 默认要求 Q.Value < 0.01、Lib.PG.Q.Value < 0.01，蛋白组与定量值有效；Spectronaut 使用对应核心字段检查。
每个条件至少需要 2 个生物学重复；每个比较只使用当前处理组与对照组。
默认按校正 p 值 ≤ 0.05 且 |log2FC| ≥ 1 筛选，并保留全部可计算结果用于复查。
至少两条合格肽段支持，同一阈值采用严格的 p 值 < 0.05 与 |log2FC| > 1 边界。
还不确定文件是否正确？先用论文 Demo 练习。
预计算 Demo 打开即显示结果；练习模式会载入可重复提交的三类输入，并按用户上传流程逐步展开。
网站提供的使用改进
- 兼容 DIA-NN 主报告和按模板导出的 Spectronaut TSV，并允许保留附加列。
- 在线识别样品、编辑实验设计，并在计算前给出明确检查结果。
- Demo 与用户任务使用同一结果结构，图表、作图数据和明细表可联动浏览。
- 登录后可保存任务和数据集，便于长期复用与复查。
结果边界：显著肽段或切割位点提示局部蛋白酶可及性变化。候选结果应结合重复一致性、蛋白总量、肽段位置、已知结构域与正交验证共同解释。
输入过滤与定量层级
DIA-NN 报告先应用 Q.Value < 0.01、Lib.PG.Q.Value < 0.01、蛋白组非空、前体定量非空且 > 1.1 的规则。Spectronaut 报告需按模板导出完整的样本、蛋白组、肽段、前体及 MS1/MS2 定量字段；核心过滤使用 PG.ProteinGroups 非空、FG.Quantity 非空且 FG.Quantity > 1.1。
结果分别保留全肽段、非限制性半特异切割位点和由至少两条通过标准的肽段支持的蛋白层级信息。
缺失值与差异检验
定量矩阵按每个实验条件检查有效重复，至少 2 个重复具有定量值才进入比较。完整缺失组按预设缺失值填补规则处理，解释时仍需结合原始重复覆盖度；组间差异采用兼容 limma 无权重两组比较模型的经验贝叶斯 moderated t 统计。
多重检验同时保留经验贝叶斯模型、组内比较和实验范围的校正结果。依照原 DIA-LiPQuan 规则，肽段和切割位点筛选使用校正 p 值 ≤ 0.05 且 |log2FC| ≥ 1；蛋白层需至少两条合格肽段支持，并使用严格的 p 值 < 0.05 且 |log2FC| > 1。
切割位点与结果解释
胰蛋白酶限制性位点按 K/R 识别；半特异肽段的非 K/R 端点用于构建直接切割位点证据。肽段丰度变化可反映局部蛋白酶可及性变化，但不能单独证明特定三维结构。
候选蛋白应结合肽段位置、重复一致性、蛋白总量、已知结构域与正交验证共同解释。
方法依据与适用范围
混合 LiP 蛋白组基准包含 170,400 条独特 LiP 肽段，其中 83,044 条为完全特异肽段，87,356 条为半特异肽段；基准比较了 7 种 DIA 分析流程，并据此建立 DIA-LiPQuan。
内置主 Demo 使用论文补充表 S1/S2 的确定性网页子集和本地 UniProt 复合 FASTA，并与用户上传任务共用原 DIA-LiPQuan 定量、缺失值、差异检验、切割位点和蛋白汇总路线。Python 仅替代网页服务器上的 R 运行环境，不另设一套 Demo 算法。论文图表复核数据另以独立下载包提供。
阅读 Analytical Chemistry 论文软件介绍 · Hybrid LiP proteome benchmark
把 DIA LiP-MS 报告转成可追溯的构象证据
DIA-LiPQuan 面向限制性蛋白水解质谱数据，将 DIA-NN 或 Spectronaut 的定量结果统一整理为肽段、非限制性切割位点和蛋白层级证据。分析流程覆盖输入检查、定量汇总、缺失值处理、两组差异检验、多重校正和结果浏览。
DIA-NN / Spectronaut
Peptide → cut site → protein
原路线 · Python 运行环境
Reusable datasets
00
三种方式快速上手
先用论文数据理解结果，再按模板准备自己的定量报告、FASTA 与实验设计。
Demo 与用户上传任务共用同一套五类结果、交互图表和浏览功能。Demo 是补充表的确定性网页子集；完整论文图表复核数据可单独下载。
在线 README · Demo guide
文献数据 Demo 与重复上传
主 Demo 的定量值来自论文补充表 Table S1 与 Table S2 的 DIA-NN DDALib peptide 工作表；线性强度由原始 log2 强度执行 2x 转换，缺失值保持缺失。复合 FASTA 由本地 UniProt 2026_02 的人 UP000005640、酵母 UP000002311 reviewed 条目和可解析的 cRAP v1.0 1/2 类污染物组成。默认结果按原 DIA-LiPQuan 路线预计算，无需等待即可打开。
文件清单
- DIA-NN report
- 来自补充表真实定量行，保留 H0、H2、H5、H7.5、H30 的全部可用分组；人源表无 H0，不进行人为补值。
- FASTA
- 完整包含 20,329 条人源 reviewed、6,066 条酵母 reviewed 和本地可解析的 50/57 条 cRAP 1/2 类目标序列；不含 decoy。输入包附逐条来源与序列哈希。
- Experiment layout
- 20 个样品运行、5 个条件、每个条件 4 个重复；同时分析 H2_vs_H5、H7.5_vs_H5 与 H30_vs_H5，也可从报告在线识别并编辑。
- Paper validation
- 与本软件相关的论文量化、鉴定和差异参考数据保留为独立复核包，不替代正式分析结果。
- Integrity metadata
- 记录论文 DOI、iProX 编号、源文件大小、SHA-256、计算规则和关键数值核对结果。
DIA-NN 文件识别：选择 Main output 指定的逐前体主报告；常见为 report.tsv、<project>.report.tsv 或 report.parquet。不要使用 pg_matrix、pr_matrix、谱库或 .quant 文件替代。
快速开始
- 点击“查看 Demo 结果”，无需排队或计算即可按论文顺序打开 Figure 2、Figure 3A、单管线差异汇总、CV 质控和五类正式结果。
- 先按物种和比较浏览完整概览；再从左侧切换切割位点、肽段或蛋白层级，右侧图表、作图数据和明细表会同步更新。
- 点击“载入 Demo 输入并练习提交”，或下载 ZIP 后上传 report 与 FASTA；experiment-layout 可直接使用，也可从 report TSV 在线重新生成。
- 分析自己的数据时，上传实际 DIA 主报告；FASTA 可在同一卡片中上传本地文件，或从 UniProt 选择并自动带回，再从报告在线识别实验设计或上传真实设计表。
复现边界
网页 Demo 是从补充表确定性抽取的可重复上传子集，使用与论文同组成原则的本地 UniProt 复合 FASTA；本地 2026_02 与论文 2024 年 10 月条目可能有轻微序列或退役 accession 差异。Demo 与用户上传共用原 DIA-LiPQuan 分析路线，论文接近度只用于复核，不参与选样或改变算法。
分析对象
LiP-MS 专用分析的质量控制要求
LiP-MS 通过比较不同条件下蛋白区域的蛋白酶可及性，捕捉与局部构象变化相关的肽段丰度差异。大量半特异肽段会显著扩展检索空间，也使定量汇总、缺失值处理和差异判断比常规蛋白质组学更复杂。
DIA-LiPQuan 将肽段变化沿序列映射到切割位点，并同步保留蛋白总量和重复覆盖信息，使候选结果能够回到原始证据逐层核查。
核心能力
一个入口完成检查、计算与结果管理
- 双引擎输入读取 DIA-NN 主报告，或采用模板导出的 Spectronaut TSV。
- 在线设计与检查识别样品列，在线编辑条件和重复，并检查必需列、额外列、定量值与样品映射。
- 分层定量从前体与肽段汇总到非限制性切割位点和蛋白层级。
- 可解释统计保留重复覆盖、log2FC、原始 p 值和多种校正结果。
- 原路线 Python 执行保留原 DIA-LiPQuan 的 MaxLFQ、缺失值、差异检验、BH 校正、切割位点和双肽段蛋白规则；用户无需安装 R。
- 长期复用登录后保存任务，浏览结果并复用同一输入重新计算。
研究基准
混合 LiP 蛋白组设计与 DIA 分析流程
人源膜蛋白与酵母蛋白组成比例已知的双物种体系，用于同时评估鉴定深度、定量准确性、假阳性控制和差异分析表现。
03
从报告到候选位点的五个步骤
每一步都保留可下载的中间表和判断字段，便于复查与后续验证。
- 1准备输入定量报告、搜索所用 FASTA 与 run/condition/replicate 实验设计表。
- 2检查设计核对报告字段、样本名称、重复数和处理组与对照组方向。
- 3构建定量层级统一前体和肽段信号，并映射半特异肽段的非 K/R 切割端点。
- 4执行差异统计计算两组比较、经验贝叶斯 moderated t 统计和多重检验校正。
- 5浏览与解释联查火山图、结果表、肽段位置、蛋白总量和重复覆盖。
适用场景
结构蛋白质组学与靶标研究
小分子作用靶标筛选
蛋白局部构象变化
疾病相关构象标志物
蛋白相互作用研究
结果边界
肽段变化是候选证据，不是结构定论
显著肽段或切割位点提示局部蛋白酶可及性发生变化。解释时应结合重复一致性、蛋白总量、肽段位置、已知结构域和正交实验，不能仅凭单条肽段推断确定的三维构象。
研究来源
Evaluating DIA LiP-MS Analysis Workflows with a Hybrid LiP Proteome Benchmark
该研究由上海科技大学 iHuman 研究所与生命科学与技术学院水雯箐课题组开展，并与上海易算生物科技有限公司合作开发 DIA-LiPQuan 在线分析平台。论文发表于 Analytical Chemistry。