质谱原理与近十年蛋白质组学发展

Guo et al. 2025 Fig. 1

MS-based proteomics 的完整工作流

现代 MS-based proteomics 从样本进入仪器之前就已经开始决定数据质量。体液、组织和单细胞对应完全不同的蛋白丰度范围、基质复杂度和可用起始量；自动化前处理的价值在于降低人为误差、减少转移损失，并让消化、脱盐、标记和上机顺序在大队列中保持一致。低输入样本尤其容易受到管壁吸附、污染蛋白和干燥损失影响，因此样本处理不能只用“总蛋白量”评价，还要同时看回收率、批内 CV、空白背景和肽段分布。

图中的 multiplexing by chemical labelling 指向两类常见策略：等重标记适合在 MS2 或 MS3 层面比较多个样本，非等重或质量差标记可与 DIA 结合提升通量。多重化可以减少缺失值并提高通量，但也会引入通道串扰、比例压缩、标记效率和 channel-specific FDR 等问题。进入 LC 后，色谱柱、梯度长度、柱温和流速共同决定峰宽、峰容量和低丰度肽段是否能从背景中分开；短梯度能提高通量，但对仪器扫描速度和软件去卷积提出更高要求。

DDA、DIA 和 targeted acquisition 代表三种不同的信息采集哲学。DDA 逐个选择强前体碎裂，谱图解释直观但重复性受采样随机性影响；DIA 系统性碎裂窗口内所有离子，适合队列一致性和回溯分析；PRM/MRM 则围绕预先定义肽段建立高特异性验证方法。数据分析不只是“搜库”，还包括谱图库或预测谱图、保留时间/iRT 校准、峰组评分、蛋白推断、FDR 控制、归一化、批次校正和网络/通路解释。

• 低输入样本：优先控制回收率、污染、转移损失和空白背景，而不是单纯追求最高鉴定数。
• DIA 项目：窗口设计、谱图库或 directDIA 策略、峰组评分和缺失值模式共同决定队列可信度。
• 临床队列：样本前分析、自动化批次、QC 样本、报告版本和数据留痕必须同步设计。

Guo et al. 2025 Fig. 2

单细胞与空间蛋白组

单细胞蛋白组学把蛋白质组测量从群体平均推进到细胞异质性层面。它能区分同一组织或同一培养体系中的细胞状态、药物响应和稀有亚群，但每个细胞的蛋白量极低，导致肽段损失、随机缺失和批次效应被显著放大。常见策略包括高回收率芯片或纳升级反应体系、载体通道、低流速 LC、高灵敏 MS/MS 和面向稀疏数据的软件处理。单细胞结果需要同时说明细胞数、每细胞蛋白覆盖度、缺失值分布、批次结构和归一化策略。

空间蛋白组学的关键不是把组织切成很多点后简单做 LC-MS/MS，而是在蛋白读数中保留组织坐标。激光显微切割、微流控采样、成像质谱、抗体成像和 LC-MS-based spatial proteomics 各有分辨率、覆盖深度和定量精度差异。空间结果需要把 ROI、细胞组成、邻域关系、病理区域和蛋白通路联系起来；如果组织区域过小，蛋白覆盖度会下降，如果区域过大，又会重新回到混合平均信号。

Guo 等 2025 年综述把单细胞与临床应用放在同一条发展线上，是因为低输入能力会直接影响穿刺样本、FFPE、微区组织、循环肿瘤细胞和类器官模型。相关引用中的单细胞报告建议强调实验设计、缺失值、批次和数据共享规范；空间蛋白组年度方法强调 atlas-scale 组织图谱、组织病理联动和多模态整合。

• 单细胞：每细胞蛋白数、缺失值、carrier 风险、批次校正和细胞注释必须共同报告。
• 空间：ROI 大小、采样深度、组织结构、空间邻域和病理标注决定解释边界。
• 共同基础：高灵敏仪器、低损耗前处理、稳定 LC 和稳健软件缺一不可。

Guo et al. 2025 Fig. 3

从 discovery 到临床 assay

临床蛋白质组学的核心矛盾是：discovery 阶段希望尽可能广地覆盖蛋白和通路，临床 assay 阶段则要求稳定、可复核、可解释和可跨中心迁移。一个差异蛋白只有在样本前分析、检测方法、阈值、适用人群和验证证据都明确时，才可能成为 biomarker。血浆、尿液、脑脊液、组织和 FFPE 的前分析变量不同，采血管、离心、冻融、储存时间、溶血和批次都会改变蛋白信号。

从 discovery 进入 verification 时，通常需要把大规模 DIA 或 DDA 发现的候选蛋白压缩为可验证 panel。PRM/MRM 能针对候选肽段进行高特异性定量；稳定同位素内标可以校准回收率和仪器波动；SISCAPA 等免疫富集路线可把低丰度目标从复杂基质中拉出，提高灵敏度和特异性。进入临床队列后，单个项目的“显著差异”不够，必须评估跨队列复现、批次稳定性、干扰因素、模型校准和临床终点相关性。

药物研发中的 proteomics 还会把 abundance、PTM、热稳定性、靶点占有、通路反馈和毒性 readout 放在一起。此时质谱结果既可以用于靶点发现，也可以用于机制验证、药效标志物和伴随诊断候选。临床转化的落点不是把全蛋白质组报告原样交付，而是形成可维护的 assay、QC 体系和结果解释规则。

• discovery：用于寻找候选蛋白、通路和亚型信号，重点是覆盖度、FDR 和队列结构。
• verification：用于评估候选是否可重复、可定量、可转移，重点是目标肽段和内标体系。
• clinical assay：需要 SOP、质控品、批次记录、阈值规则、模型验证和可追溯数据管理。

Guo et al. 2025 Fig. 4

AI 对质谱蛋白质组学的增强

AI 在质谱蛋白质组学中的作用已经从“结果建模”前移到实验和数据处理的多个环节。深度学习模型可以预测肽段碎片谱、保留时间和离子淌度，从而减少实验建库依赖，支持 library-free 或 hybrid library 分析；在 DIA 数据中，AI 可帮助识别共洗脱峰组、区分干扰峰、改进 q-value 估计和提高低丰度肽段的识别稳定性。Carafe、Prosit、DIA-NN 等方向都体现了预测谱图和深度学习评分对 DIA 的推动。

AI 也进入 QC 和临床解释。iDIA-QC 等工作把大规模 DIA 的质量控制从人工阈值推进到模型评分，能识别色谱漂移、喷雾不稳、批次异常和样本异常。临床模型中，机器学习可以把多蛋白 panel、临床变量和疾病终点整合为风险评分，但训练集偏倚、样本前分析差异、平台差异和过拟合会直接影响可转移性。

AI 增强不能替代实验设计。模型预测再强，也需要稳定的 LC-MS/MS 输入、清楚的样本分层、独立验证集和可解释的错误控制。对于教学和项目设计，AI 应被理解为提高谱图识别、质量控制和多变量解释能力的工具，而不是绕过 FDR、QC 和生物学验证的捷径。

• 数据处理：谱图、保留时间和离子淌度预测能降低实验建库成本，提高 DIA 启动效率。
• 质量控制：模型评分可帮助识别仪器漂移、批次异常和样本异常，但仍需可解释阈值。
• 临床预测：需要跨队列、跨平台、前瞻性验证和清楚的模型适用边界。

Aebersold & Mann 2016 Fig. 1

Bottom-up proteomics 工作流

Bottom-up proteomics 将蛋白酶切为肽段后再进入 LC-MS/MS，是当前大多数 discovery proteomics 的基础路线。它的优势是可处理复杂样本、兼容高通量 LC-MS/MS、数据库搜索成熟，并能在组织、细胞、体液和微量样本中获得较深覆盖。其核心推断逻辑是“肽段证据支持蛋白存在和定量”，因此唯一肽段、共享肽段、蛋白组装规则和 protein inference 会直接影响最终蛋白列表。

这一路线也带来天然限制。蛋白被切成肽段后，完整蛋白异构体、剪接体、蛋白加工形式和多个 PTM 的组合关系可能丢失；同一肽段可能来自多个同源蛋白；某些区域因酶切位点、疏水性或离子化效率不佳而难以覆盖。Top-down 和 middle-down proteomics 可以补充完整蛋白或较长片段信息，但对仪器、分离和数据解释要求更高。

• 鉴定层面：PSM、peptide、protein 三个层级的 FDR 不能混为一谈。
• 定量层面：肽段强度需要经过峰提取、归一化、缺失值处理和蛋白汇总。
• 解释层面：蛋白列表只是入口，仍需结合 PTM、互作、定位和通路。

Aebersold & Mann 2016 Fig. 2

翻译后修饰分析

翻译后修饰决定蛋白活性、定位、稳定性和互作状态，是蛋白质组学区别于基因组和转录组的重要层面。磷酸化常用于追踪激酶/磷酸酶网络，乙酰化连接染色质和代谢状态，泛素化连接蛋白降解和应激响应，糖基化与分泌蛋白、膜蛋白和免疫识别关系密切。质谱通过修饰肽段的质量偏移和碎片离子来定位修饰位点，但修饰肽通常丰度低、动态范围宽，常需要 TiO2、IMAC、抗体富集或化学富集策略。

PTM 结果的关键风险在于位点定位和定量归因。一个修饰肽显著变化，可能来自修饰比例变化，也可能来自该蛋白总量变化；一个肽段包含多个潜在修饰位点时，需要使用 site localization probability、diagnostic ions 和谱图质量判断位点是否可靠。对于通路解释，位点功能注释、激酶 motif、时间序列和扰动设计比单次差异列表更重要。

• 实验设计：富集策略决定可见修饰类型，样本量和起始蛋白量决定深度。
• 数据分析：修饰位点、修饰肽段和对应蛋白总量应分开建模。
• 生物解释：位点方向、通路上下游和时间动态共同决定机制可信度。

Aebersold & Mann 2016 Fig. 3

互作与结构蛋白组

蛋白质在细胞中通常以复合物、通路模块和结构状态发挥功能。AP-MS 通过亲和纯化 bait 蛋白捕获复合物，适合发现稳定或半稳定互作；BioID、TurboID 和 APEX 等邻近标记可以捕获瞬时或局部邻近关系；cross-linking MS 通过交联剂记录蛋白内部或蛋白之间的空间距离；limited proteolysis、HDX-MS、CETSA 和 thermal proteome profiling 可以把构象变化、配体结合和热稳定性变化转化为肽段或蛋白信号。

结构与互作蛋白组学的结果不能简单解释为“有互作/无互作”。裂解条件、标签位置、交联剂长度、细胞状态、背景蛋白、复合物动态和统计过滤都会改变结果。SAINT 等方法用于 AP-MS 背景建模，BioPlex 等大规模网络把互作结果放到系统层面，药物研发场景则常用热稳定性或化学蛋白组学判断靶点结合、脱靶效应和通路反馈。

• 互作证据：需要阴性对照、重复、背景模型和 bait/prey 方向信息。
• 结构证据：通常提供距离、稳定性或可及性约束，而不是完整三维结构本身。
• 机制解释：应结合丰度变化、PTM、定位和功能实验，避免单一证据过度外推。

Aebersold & Mann 2016 Fig. 4

Proteotype 状态与表型

Proteotype 指一个生物系统在特定遗传背景、环境、时间点和细胞状态下的蛋白质状态集合。它不是蛋白表达量的同义词，而是包括蛋白丰度、剪接/加工形式、PTM、蛋白复合物、亚细胞定位、周转速率和结构状态的综合表型。基因组提供潜在编码能力，转录组提供 RNA 层面响应，而 proteotype 更接近实际执行细胞功能的分子状态。

疾病、药物处理、发育阶段和微环境改变都会重塑 proteotype。肿瘤样本中，同一驱动突变可能对应不同蛋白通路活性；药物处理后，靶点丰度不一定变化，但热稳定性、磷酸化、互作或下游通路可能发生改变；临床体液样本中，炎症、凝血、组织泄漏和免疫反应会共同影响蛋白组合。蛋白质组学的价值正是在这些层面把 molecular state 与 phenotype 连接起来。

• 状态集合：丰度、PTM、互作、定位和周转共同构成 proteotype。
• 项目设计：不同问题需要不同 readout，不能用总蛋白表达覆盖所有机制问题。
• 结果交付：临床或药物项目应把蛋白状态转换为可解释的通路、panel 或 assay。