细胞亚群
识别组织或培养体系中蛋白表达不同的细胞群，并用独立标志验证。
Single-cell proteomics
单细胞蛋白质组学
单细胞蛋白质组学在细胞级尺度测量蛋白表达与状态，适合研究细胞异质性、稀有亚群和连续状态变化。结果上限由分选、低损耗处理、离子统计、采集速度、匹配控制和细胞级 QC 共同决定。
细胞异质性低损耗处理高灵敏质谱细胞级 QC
Biological question
只有细胞间差异构成核心问题时才需要单细胞
bulk 蛋白质组提供群体平均值，单细胞路线增加细胞分辨率。它适用于稀有细胞、细胞状态连续变化、治疗响应异质性和无法通过预先分群解决的问题。
单细胞识别数通常低于 bulk。项目价值应由细胞类型分辨、状态重建和生物学解释衡量，而不是只看每个细胞的蛋白数量。
连续状态
观察分化、应激、细胞周期或药物反应沿连续轴的蛋白变化。
稀有事件
研究数量很少但可能决定表型的细胞；前提是分选和污染控制足够稳定。
| 问题 | 推荐路线 | 原因 |
|---|---|---|
| 组织平均蛋白表达差异 | 高质量 bulk discovery | 输入充分、深度高、定量稳定，通常更直接。 |
| 已知细胞类型间差异 | 分选后低输入或小群体蛋白质组 | 可在深度和细胞分辨率之间取得平衡。 |
| 未知亚群与连续异质性 | 单细胞蛋白质组 | 保留单细胞尺度，允许数据驱动分群与轨迹分析。 |
| 需要组织位置 | 空间蛋白质组或联合设计 | 细胞悬液会丢失原始空间坐标。 |
Cells and preparation
单细胞项目首先是样本损失控制工程
细胞分离、转移、裂解、消化和标记的每一步都可能损失大量材料。容器表面、反应体积、自动化重复性和空白污染往往比增加一种分析算法更先决定结果。
建立稳定的 cell ID，把分选孔位、板号、处理批次、载体或标签、LC-MS run 与最终矩阵保持一一对应。
细胞制备
控制解离应激、活率、双细胞和细胞类型偏倚。
分选与索引
记录门控、孔位、散射与荧光信息。
低体积裂解
减少转移、表面吸附与非特异背景。
消化与标记
控制酶量、反应时间、载体和通道平衡。
过程 QC
使用空白、标准样和板内重复监控污染与漂移。
Literature workflow
Label-free 路线需要同时优化前处理、色谱、采集和应用目标
- 样品制备
多孔板、毛细管或专用芯片都以减少转移和表面吸附为目标；需要在通量与回收率之间验证。
- 色谱分离
低流速和窄峰提高灵敏度，但柱稳定性、峰容量、运行寿命和重复性必须同步评估。
- 质谱采集
DDA、DIA 与离子淌度路线的速度、灵敏度、分辨率和数据完整性不同，不能只比较单次鉴定深度。
- 应用解释
肿瘤、组织图谱、分化和细胞异质性研究都需要把细胞级结果汇总回个体和生物学重复。
Mass spectrometry
平台组合决定深度、通量与完整性的平衡
高灵敏前端、窄峰分离和高速 MS/MS 提高低输入可测性。label-free、TMT/carryover、plexDIA 等策略对通量、定量方式和错误控制的要求不同。
采集速度增加后，候选 transfer、channel-specific FDR 和 precursor 级质量过滤更重要。仪器性能不能替代适合单细胞的统计设计。
Label-free
流程直观、无通道载体，但每个细胞独立进样，对稳定性、通量和缺失控制要求高。
等重标记
提高通量并可用载体增强识别，但要控制 ratio compression、通道泄漏和载体对定量的影响。
plexDIA
利用非等重标签与 DIA 提升通量，需要通道特异候选、FDR、干扰与定量规则。
Data and QC
细胞级 QC 应先于聚类和差异分析
低输入使缺失、错误 transfer 和技术噪声更容易被放大。必须区分空孔、低质量细胞、批次异常和真实低蛋白状态，再进行归一化、降维、聚类和差异分析。
高完整度不一定更真实。任何 matching 或插补策略都需要在受控数据中评估 false transfer，并保留原始检测矩阵。
| 层级 | 重点指标 | 不能直接推断 |
|---|---|---|
| 单细胞 | 肽段/蛋白数、总强度、缺失率、背景、RT 与质量误差 | 蛋白数低的细胞不一定就是技术失败。 |
| 批次/板 | 中心趋势、QC 稳定性、板位效应、通道平衡 | 批次校正不能自动恢复丢失的生物差异。 |
| 聚类 | 稳定性、marker、批次混合、重复重采样 | 二维图分开不等于亚群具有生物学意义。 |
| 差异 | effect size、检出比例、样本层级与 FDR | 不能把细胞数直接当作独立个体数。 |
空白与污染
识别角蛋白、胰蛋白酶和通道泄漏。
低质量细胞
用多指标判定，不用单一蛋白数阈值。
批次检查
比较板、run、标签和处理日期。
稳健分群
评估 marker、重复采样和参数敏感性。
样本层统计
避免细胞伪重复，保留个体层级。
Interpretation and validation
结果要回到细胞身份、状态和样本层证据
可靠结论需要已知标志、独立方法、样本间一致性和明确的效应大小。单细胞特有的漂亮聚类图只是入口，不是最终机制证据。
报告应同时展示细胞数、个体数、批次、保留标准、原始检出、插补比例和 marker 来源，使亚群结论可以复核。
细胞身份
用多蛋白 marker、已知生物学和必要的正交检测确认，避免单一 marker 命名。
状态与轨迹
连续轴需要时间、扰动或独立数据支持；降维顺序不能自动代表真实时间。
候选验证
用流式、成像、PRM、功能扰动或独立队列验证关键细胞群和蛋白标志。