组织区室
比较肿瘤核心、浸润前沿、间质、坏死区或不同组织层，输出区域级差异与通路。
Spatial proteomics
空间蛋白质组学
空间蛋白质组学把蛋白表达重新放回组织结构。研究对象不是“更小的一块组织”，而是具有位置、形态、细胞组成和病理语境的区域。ROI 定义、取样精度、低输入损失和区域间比较共同决定结果能否解释。
ROI 设计显微取样低输入 LC-MS空间解释
组织切片病理标注ROI显微取样LC-MS/MS空间蛋白图谱
Question and scale
空间技术只在位置本身构成问题时增加价值
如果样本之间的平均蛋白丰度已经能够回答问题，高质量 bulk 蛋白质组通常更直接。空间路线适用于肿瘤边缘与核心、病灶与邻近组织、不同解剖层、微环境或病理形态区域之间的比较。
先确定最小可解释 ROI，再决定切片厚度、区域面积、重复数和仪器路线。分辨率越高，单个区域输入越低，随机损失和缺失越突出。
病理表型
由病理染色、免疫标志或细胞形态定义 ROI，蛋白结果必须回到原始图像复核。
细胞邻域
关注某类细胞周围的微环境，但组织级 LC-MS ROI 不等同于真正单细胞分辨率。
| 研究问题 | 适合的空间单位 | 主要限制 |
|---|---|---|
| 病灶与邻近区域差异 | 形态明确的宏观或显微 ROI | 区域细胞组成差异可能主导蛋白变化。 |
| 肿瘤微环境分区 | 核心、边缘、间质或免疫富集区 | 需要病理标注和足够生物学重复。 |
| 稀有结构或微区 | 小面积 LMD ROI 或重复区域池化 | 输入极低，缺失、污染和 carryover 风险增大。 |
| 空间 atlas | 规则网格或连续解剖分区 | 批次、切片位置和配准误差会累积。 |
Sampling workflow
图像、ROI 与样本管必须保持一一对应
空间项目从切片开始就要保存方向、层面、染色、ROI 边界和取样批次。仅保留最终蛋白表，会失去最关键的位置证据。
每个 ROI 应有稳定 ID，并关联切片、坐标、面积、病理标签、取样时间、处理批次与质谱 run。分析结果使用同一 ID 回写图像。
连续切片
规划病理、免疫或质谱切片，记录组织方向与层面。
图像与标注
统一扫描参数，由病理或预定义规则标出 ROI。
显微取样
采用 LMD、微量打孔或其他区域分离方式收集样本。
低损耗处理
控制表面吸附、转移次数、反应体积和批量一致性。
ID 回写
把 LC-MS 文件、蛋白矩阵和统计结果关联到原 ROI。
Literature workflow
从组织图像到可回写的空间蛋白结果
Deep Visual Proteomics 将高分辨成像、细胞分割、表型分类、激光显微切割和超高灵敏质谱连接为同一条证据链。图像中的对象必须在取样、质谱和结果矩阵中保持同一个身份。
- 组织与图像
组织切片先经过高分辨显微成像；形态、染色和原始坐标是 ROI 定义的依据，不能在取样后补建。
- 分割与表型分类
图像模型把细胞或亚细胞对象分割并按表型分类。模型输出需要人工复核和已知标志验证。
- 激光显微切割
选中的对象由 LMD 自动切割并进入对应容器。切割轮廓、孔位和样本 ID 应同步保存。
- 质谱与空间回写
低损耗处理和超高灵敏 LC–MS 生成蛋白矩阵，随后按原始对象 ID 回写图像并进行表型比较。
- a–b：训练与验证分割
人工标注、合成训练图和独立组织用于训练与检验分割模型；ROI 不是仅凭一个阈值自动生成。
- c–d：把轮廓转成真实取样
扫描显微镜产生对象轮廓，LMD 软件优化切割路径并把对象送入对应孔位；切割前后图像可用于确认回收。
- e–g：检查表型纯度
免疫标志、PCA 和标志蛋白热图用于判断不同表型组是否被正确分离，而不是只比较每组鉴定数。
- h：解释差异蛋白
火山图提供效应与统计证据，但候选仍需回到组织位置、肽段证据和独立切片验证。
LC-MS strategy
低输入空间样本需要在深度、速度和完整性之间取舍
小 ROI 通常适合低流速、高回收前处理和高灵敏采集。项目规模扩大后，还要控制梯度、进样顺序、carryover、仪器漂移和空白。
仪器灵敏度不能补偿 ROI 定义错误。先保证区域可解释和重复充分，再比较更长梯度、分级或更激进的 matching。
单次 ROI discovery
优先保证低损耗和高灵敏，可采用 DIA 或适配低输入的 DDA，并设置足够空白。
大规模空间队列
缩短梯度前必须验证跨批次 CV、识别完整度和区域分离能力，固定 QC 插入规则。
靶向复核
对区域标志肽段使用 PRM 或其他靶向策略，在独立切片或样本中验证空间差异。
Analysis and QC
空间矩阵必须同时检查技术质量和区域组成
空间差异可能来自真实区域生物学，也可能来自输入量、面积、细胞密度、切片批次或取样污染。统计模型应保留样本、切片和 ROI 的层级结构。
把同一切片的多个 ROI 当作独立生物学重复会夸大样本量。区域重复、切片重复和个体重复必须分开标记。
| 检查层 | 建议指标 | 异常解释 |
|---|---|---|
| 取样 | ROI 面积、像素、细胞密度、取样时长与空白 | 面积或密度差异可能造成总量偏移。 |
| 质谱 | TIC、峰宽、RT、肽段数、蛋白数、carryover | 小 ROI 更容易受污染和随机离子采样影响。 |
| 矩阵 | 缺失率、CV、批次、个体内相关与区域内相关 | 过度 matching 可能提高完整度但引入错误转移。 |
| 病理 | 细胞组成、组织纯度、标志蛋白和图像标签 | 区域差异可能主要反映细胞比例而非细胞内变化。 |
原始 QC
排查进样、色谱、空白和批次异常。
层级建模
保留个体、切片、区域和重复关系。
区域比较
按预设对比计算差异并校正多重检验。
组成校验
用病理和细胞标志判断区域纯度。
图像回写
把蛋白、通路和不确定性映射回位置。
Interpretation and delivery
可交付结果应让区域、蛋白和证据互相跳转
最终报告不仅需要差异表，还应提供 ROI 图、区域元数据、样本层级、质量控制、空间热图、标志蛋白和通路结果，并说明哪些结论来自直接测量、统计推断或外部注释。
空间热图的颜色必须对应可复核数值，并显示缺失、尺度和归一化方式。不要把插值图像呈现为实际像素测量。
区域结果
每个 ROI 的蛋白数、定量强度、质量指标和病理标签能够联动查看。
差异与通路
按预设区域对比输出 effect size、置信区间、FDR 与功能模块，而不是只展示显著性。
验证清单
优先选择位置明确、肽段证据稳定、跨个体一致且有病理意义的候选进入靶向或成像验证。